司。
[0040] 1.3DNA 分析軟件：
[0041] PCR引物設(shè)計軟件：Primer Premier 5;
[0042] 數(shù)據(jù)分析軟件:SPSS 13.0;
[0043] 2.實驗方法：
[0044] 本實驗采用的是TIANGEN公司DNA提取試劑盒對中國荷斯坦奶牛的血液進行的全 基因組DNA提取，同時設(shè)計引物進行PCR擴增，將其產(chǎn)物進行測序從而找到SNP位點，然后對 單個樣品的PCR產(chǎn)物進行直接測序。根據(jù)其測序結(jié)果進行關(guān)聯(lián)分析。下面是對本發(fā)明做的進 一步詳細描述，所述僅是對本發(fā)明的解釋不是限定。
[0045] 2.1全基因組DNA的提取，按照說明書進行操作，最后用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢 測基因組DNA的質(zhì)量，置于-80°C冰箱保存?zhèn)溆谩?br>[0046] 2.2PRSS2基因 PCR擴增的引物設(shè)計，根據(jù)Ensemb 1數(shù)據(jù)庫(ENSBTAT00000028731)提 供的牛PRSS2基因序列，應(yīng)用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物，并由上海生工生物技術(shù)有 限公司合成。
[0047] 引物序列為：PRSS2-F : 5 ' GCCCTTGACATTCCTACACG 3 ' PRSS2-R : 5 'CGTAGCCCCAGGACACAAT 3 '將所設(shè)計的引物進行PCR擴增，對得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂 糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖1所示，擴增的片段大小與目的基因的大小相符，無雜帶，條帶清 晰，沒有二聚體，表明所設(shè)計的引物可以用于后續(xù)實驗。反應(yīng)體系為50ul體系，見表1;反應(yīng) 程序為：95°C預(yù)變性5min; 95°C變性30s，58°C退火30s，72°C延伸45s，35個循環(huán)；延伸72°C lOmin，最后16°C保存。
[0048] 表1、PCR反應(yīng)體系：
[0049]
[0050] 2.3PCR混池擴增產(chǎn)物測序
[0051] 將每50個不同模板的PCR擴增產(chǎn)物進行混合，送到北京金唯智測序，然后對其測序 結(jié)果進行分析，找出SNP位點。根據(jù)PRSS2引物對A的PCR測序結(jié)果，找到5個SNP位點分別在核 苷酸序列上535bp處存在G到A的突變，678bp處存在A到T的突變，715bpp處存在G到A的突變， 725bpG到C的突變，944bp處存在T到C的突變。如圖2-圖16所示。
[0052] 2.4直接測序檢測牛PRSS2基因的單核苷酸多態(tài)性，將單個樣品都進行PCR擴增，送 到北京金唯智測序，反應(yīng)體系和反應(yīng)程序與混池擴增相同。對每一個樣品及基因型都進行 分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：
[0053] 對于SNP1(I3-265G>A)GG型有27頭，AA型有46頭，AG型有98頭。GG的基因型頻率為 0.1579，AA的基因型頻率為0.2690，AG的基因型頻率為0.5731，G等位基因頻率為0.4444，A 等位基因頻率為0.5556;因此A等位基因占優(yōu)勢，以雜合型AG為主要的基因型，且符合哈代 溫伯格平衡。
[0054] 對于SNP2(E4_31A>T)為錯義突變，突變前編碼谷氨酸的密碼子GAG突變成編碼纈 氨酸的密碼子GTG。該位點氨基酸的改變，造成多肽鏈的變化，可能對PRSS2基因的蛋白質(zhì)的 結(jié)構(gòu)和功能有一定的作用和影響。其中AA型有28頭，TT型有46頭，AT型有97頭。AA的基因型 頻率為0.1637，TT的基因型頻率為0.2690，AT的基因型頻率為0.5673, A等位基因頻率為 0.4474，T等位基因頻率為0.5526;因此T等位基因占優(yōu)勢，以雜合型AT為主要的基因型，且 符合哈代溫伯格平衡。
[0055] 對于SNP3(E4-68G>A)為同義突變，突變前后的密碼子為TCG和TCA均編碼絲氨酸， 絲氨酸有六種密碼子，攜帶絲氨酸的tRNA數(shù)目也較多，促進蛋白質(zhì)的翻譯進程。其中GG型有 27頭，AA型有46頭，AG型有98頭。GG的基因型頻率為0.1579，AA的基因型頻率為0.2690，AG的 基因型頻率為0.5731，G等位基因頻率為0.4444,A等位基因頻率為0.5556;因此A等位基因 占優(yōu)勢，以雜合型AG為主要的基因型，且符合哈代溫伯格平衡。
[0056]對于SNP4(E4-78G>C)為錯義突變，突變前編碼E(谷氨酸）的密碼子GAG突變成編碼 Q(谷氨酰胺）的CAG，該位點氨基酸的改變，會造成多肽鏈的變化，可能對PRSS2基因的蛋白 質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能有一定的作用和影響。其中GG型有27頭，CC型有46頭，GC型有98頭。GG的基 因型頻率為0.1579，AA的基因型頻率為0.2690，AG的基因型頻率為0.5731，G等位基因頻率 為0.4444,C等位基因頻率為0.5556;因此C等位基因占優(yōu)勢，以雜合型CG為主要的基因型， 且符合哈代溫伯格平衡。
[0057] 對于SNP5((I4-160T>C)TT型有26頭，CC型有53頭，TC型有86頭。TT的基因型頻率為 0.1576，CC的基因型頻率為0.3212，TC的基因型頻率為0.5212，T等位基因頻率為0.4182，A 等位基因頻率為0.5818;因此C等位基因占優(yōu)勢，以雜合型TC為主要的基因型，且符合哈代 溫伯格平衡。
[0058] 3. PRSS2基因5個SNP位點與中國荷斯坦奶牛乳品質(zhì)性狀之間的相關(guān)性分析，如表2 和表3所示：
[0059] 表2.PRSS2基因5個SNP位點不同基因型與中國荷斯坦奶牛奶量、蛋白、乳糖、干物 質(zhì)性狀之間的相關(guān)性分析：
[0060]
[0061] 注：同一個性狀在平均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)誤一欄里用不同字母標(biāo)注表示具有顯著性差異(P 〈0.05)，同一個性狀平均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)誤一欄里用相同字母標(biāo)注表示差異不顯著(P>0.05)。
[0062] 表3 . PRSS2基因5個SNP位點不同基因型與中國荷斯坦奶牛體細胞數(shù)、尿素氮、月旨 肪、校正奶性狀之間的相關(guān)性分析：
[0063]
[0064]
[0065] 注：同一個性狀在平均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)誤一欄里用不同字母標(biāo)注表示具有顯著性差異(P 〈0.05)，同一個性狀平均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)誤一欄里用相同字母標(biāo)注表示差異不顯著(P>0.05)。
[0066] 4. PRSS2基因5個SNP位點間的單倍型分析及連鎖反應(yīng)，如單倍型頻率如表4所示， 連鎖反應(yīng)如圖17所示。
[0067] 表4:PRSS2基因單倍型分析 [0068]
【主權(quán)項】
1. 一種利用PRSS2基因作為乳蛋白含量分子標(biāo)記的檢測方法，其特征在于:其具體方法 如下： 第一步;采取牛的血液進行全基因組DNA的提取，利用瓊脂糖凝膠電泳的方法，檢查DNA 的質(zhì)量； 第二步：以全基因組DNA為模板，以引物A為引物進行PCR擴增牛PRSS2基因片段； 引物A為F: 5 ' GCCCTTGACATTCCTACACG 3 ' ； R:5 ' CGTAGCCCCAGGACACAAT 3，； 第三步：用全基因組DNA進行混池 PCR，找到多態(tài)性的位點，PCR的反應(yīng)程序為:95°C預(yù)變 性 5min; 95°C 變性 30s，58°C 退火 30s，72°C 延伸 45s，35 個循環(huán)；延伸 72°C lOmin，最后 16°C 保 存； 第四步:對單個樣品進行測序，根據(jù)測序結(jié)果進行多態(tài)性關(guān)聯(lián)分析： 根據(jù)PRSS2引物對A的PCR測序結(jié)果，找到5個SNP位點分別在核苷酸序列上535bp處存在 G到A的突變，678bp處存在A到T的突變，715bpp處存在G到A的突變，725bpG到C的突變，944bp 處存在T到C的突變，分別是PRSS2基因第3內(nèi)含子SNP 1，即：I3-265G>A突變位點，PRSS2基因 第4外顯子SNP 2，即：E4-31A>T突變位點，PRSS2基因第4外顯子SNP 3，即：E4-68G>A突變位 點，PRSS2基因第4外顯子SNP 4，即:E4-78G>C突變位點，PRSS2基因第4內(nèi)含子SNP 5，即：14-160T>C突變位點。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用PRSS2基因作為乳蛋白含量分子標(biāo)記的檢測方法，具體為：第一步；采取牛的血液進行全基因組DNA的提取，利用瓊脂糖凝膠電泳的方法，檢查DNA的質(zhì)量；第二步：以全基因組DNA為模板，以引物A為引物進行PCR擴增牛PRSS2基因片段；第三步：用全基因組DNA進行混池PCR，找到多態(tài)性的位點，第四步：對單個樣品進行測序，根據(jù)測序結(jié)果進行多態(tài)性關(guān)聯(lián)分析；有益效果：發(fā)現(xiàn)了5個SNP位點與牛的乳品質(zhì)中乳蛋白性狀的相關(guān)性。提供了一種簡單，快速的在DNA水平上篩查和檢測與牛乳品質(zhì)性狀密切相關(guān)的遺傳標(biāo)記，可應(yīng)用于牛的分子育種。解決了SSCP、PCR—PFLP技術(shù)的繁瑣性，提高了準(zhǔn)確性和精確度。
【IPC分類】C12Q1/68
【公開號】CN105567863
【申請?zhí)枴緾N201610152992
【發(fā)明人】趙志輝, 姜平, 蘆春艷, 楊潤軍, 房希碧, 龍小娟, 肖航
【申請人】吉林大學(xué)
【公開日】2016年5月11日
【申請日】2016年3月17日