用于耐甲氧西林金黃色葡萄球菌檢測的引物、試劑盒及方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種用于耐甲氧西林金黃色葡萄球菌檢測的引物、試劑盒及方法，屬 于分子生物學(xué)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 金黃色葡萄球菌(Staphalococcus aureus)屬革蘭陽性球菌，微球菌科，葡萄球菌 屬。它能引起化膿性炎癥，當(dāng)細(xì)菌侵入血液時，可引起致病性敗血癥。
[0003] 自從上世紀(jì)40年代青霉素問世后，金黃色葡萄球菌引起的感染性疾病受到較大的 控制，但隨著青霉素的廣泛使用，有些金黃色葡萄球菌產(chǎn)生青霉素酶，能水解內(nèi)酰胺環(huán)， 表現(xiàn)為對青霉素的耐藥。為此科學(xué)家研究出一種新的能耐青霉素酶的半合成青霉素，即甲 氧西林(methici 11 in)。1959年應(yīng)用于臨床后曾有效地控制了金黃色葡萄球菌產(chǎn)酶株的感 染，但隨后1961年就發(fā)現(xiàn)了耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)，MRSA從發(fā)現(xiàn)至今感染幾乎 遍及全球，已成為院內(nèi)和社區(qū)感染的重要病原菌之一。
[0004] 自從1961年英國發(fā)現(xiàn)MRSA后，在歐美及亞洲一些國家相繼報道了MRSA所致的院內(nèi) 感染。從60年代后期到80年代，MRSA感染率大大增加。美國NNIS報道1975年182所醫(yī)院MRSA 占金黃色葡萄球菌感染總數(shù)的2.4%，1991年上升至24.8%，其中尤以500張床以上的教學(xué) 醫(yī)院和中心醫(yī)院為多，因為這些醫(yī)院里MRSA感染的機(jī)會較多，耐藥菌株既可由感染病人帶 入醫(yī)院，也可因濫用抗生素在醫(yī)院內(nèi)產(chǎn)生。歐洲1993年1417家醫(yī)院ICU分離的MRSA達(dá)60%。 而日本Kansai醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院MRSA的分離率1993年達(dá)到41 %。國內(nèi)在70年代發(fā)現(xiàn)有 MRSA，近幾年MRSA的檢出率正在逐年上升，上海1978年在200株金黃色葡萄球菌中MRSA只占 5%，1988年上升至24%，1996年激增至72% JRSA感染多發(fā)生于免疫缺陷者，大面積燒傷， 大手術(shù)后患者，長期住院及老年患者，MRSA極易導(dǎo)致感染的流行和暴發(fā)。為有效控制MRSA的 感染，以及降低疾病造成的危害，建立準(zhǔn)確、快速的檢測方法是首要任務(wù)。
[0005] 目前臨床上檢測MRSA常用的方法有細(xì)菌培養(yǎng)法和PCR法。其中，細(xì)菌培養(yǎng)法是檢測 MRSA的金標(biāo)準(zhǔn)，但該方法需要進(jìn)行藥敏實驗，通常需要3-5天才能看到最終的檢測結(jié)果，檢 測成本高、檢測周期長;利用PCR方法可在短時間內(nèi)使特定的核酸序列拷貝數(shù)幾何級數(shù)增 加，有很高的靈敏度和特異性，但缺點需要專業(yè)的檢測設(shè)備，難以在基層地區(qū)推廣。由此可 見，MRSA感染的臨床診斷，急需更簡潔、靈敏的檢測方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處而提供一種擴(kuò)增效率高、特異性強(qiáng)的 用于耐甲氧西林金黃色葡萄球菌檢測的引物。
[0007] 同時，本發(fā)明還提供了一種用于耐甲氧西林金黃色葡萄球菌檢測的試劑盒及方 法。
[0008] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為:一種用于耐甲氧西林金黃色葡萄球 菌檢測的引物，其包括上游引物mecA-f和下游引物mecA-r，上游引物mecA-f的核苷酸序列 為：5 ' -AATTTCAAACAAGTTTATAAAGATAGC-(THF)-GTTATATTTCTA-biotin-3 ' ；下游引物mecA-r 的核苷酸序列為：5'-TTGTTGTTTGATATAGTCTTCAGAAATA-(THF)-TTAGTTCTTTA-biotin-3' ；
[0009] 其中，THF為四氫呋喃，biotin為生物素。
[0010] 上述上游引物mecA-f和下游引物mecA-r，其3 '端羥基均被生物素封閉掉。此處，任 意可以與探針3'羥基共價結(jié)合的基團(tuán)均能起到封閉效果，故此處封閉3'端的羥基不限于生 物素。另，對于上游引物mecA-f而言，其中THF取代的是常規(guī)上游引物(常規(guī)上游引物的序列 為：5 ' -AATTTCAAACAAGTTTATAAAGATAGCTGTTATATTTCTA-biotin-3 '）中的 "T"。
[0011] 本發(fā)明的引物是發(fā)明人對比大量MRSA(耐甲氧西林金黃色葡萄球菌)和MSSA(甲氧 西林非耐藥金黃色葡萄球菌)菌株的基因序列，挑選MRSA特有的基因 mecA作為檢測靶點，并 針對該靶點設(shè)計、合成上下游引物所得到的。針對mecA檢測靶點，發(fā)明人設(shè)計合成了多條引 物，但實驗表明，本發(fā)明的引物特異性強(qiáng)、擴(kuò)增效率高，可有效、快速地檢測耐甲氧西林金黃 色葡萄球菌。
[0012] 由于本發(fā)明引物的3'端被封閉掉，故需先用核酸內(nèi)切酶切開THF位點，形成自由的 3'末端，才能開始擴(kuò)增反應(yīng)。由此，也提高了擴(kuò)增反應(yīng)的特異性和嚴(yán)謹(jǐn)性。
[0013] 作為本發(fā)明所述用于耐甲氧西林金黃色葡萄球菌檢測的引物的優(yōu)選實施方式，所 述上游引物mecA-f或下游引物的核苷酸序列中，有10個以下堿基的取代、添加或缺失。
[0014] 作為本發(fā)明所述用于耐甲氧西林金黃色葡萄球菌檢測的引物的優(yōu)選實施方式，所 述上游引物mecA-f和下游引物mecA-r中，至少一條引物上標(biāo)記有報告基團(tuán)。作為本發(fā)明所 述用于耐甲氧西林金黃色葡萄球菌檢測的引物的更優(yōu)選實施方式，所述報告基團(tuán)為熒光基 團(tuán)。采用報告基團(tuán)標(biāo)記引物，可為后續(xù)檢測提供方便。
[0015] 另外，本發(fā)明還提供了一種含有如上所述引物的用于耐甲氧西林金黃色葡萄球菌 檢測的試劑盒。
[0016] 作為本發(fā)明所述用于耐甲氧西林金黃色葡萄球菌檢測的試劑盒的優(yōu)選實施方式， 所述試劑盒還包括重組酶、聚合酶、DNA結(jié)合蛋白、緩沖溶液和核酸內(nèi)切酶。
[0017] 作為本發(fā)明所述用于耐甲氧西林金黃色葡萄球菌檢測的試劑盒的更優(yōu)選實施方 式，所述重組酶為T4uvsX/uvsY，所述聚合酶為Bsu DNA聚合酶，所述DNA結(jié)合蛋白為T4gp32; 所述緩沖溶液含有下述組分:Tr i s、乙酸鉀、乙酸鎂、二硫蘇糖醇、Carbowax20M、dNTPs、ATP、 磷酸肌酸、肌酸激酶和逆轉(zhuǎn)錄酶;所述核酸內(nèi)切酶為大腸桿菌核酸內(nèi)切酶IV。進(jìn)一步地，所 述緩沖溶液含有下述組分：50mmo/L Tris-HCl緩沖液、100mmo/L乙酸鉀、14mmo/L乙酸鎂、 2mmo/L二硫蘇糖醇、5 % Carbowax20M、200ymo/L dNTPs、3mmo/L ATP、50mmo/L磷酸肌酸、 lOOng/L肌酸激酶和lOOng/L逆轉(zhuǎn)錄酶;其中，Tris-HCl緩沖液的pH值為7.9。所述uvsX/uvsY 為在反應(yīng)體系中相互轉(zhuǎn)換動態(tài)平衡的兩種酶。
[0018] 作為本發(fā)明所述用于耐甲氧西林金黃色葡萄球菌檢測的試劑盒的優(yōu)選實施方式， 所述試劑盒還包括ddH20。
[0019] 最后，本發(fā)明還提供了一種采用上述試劑盒檢測耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的方 法，所述方法為重組酶聚合酶擴(kuò)增法，其包括以下步驟：
[0020] (1)提取樣本 RNA;
[0021 ] (2)配置反應(yīng)體系：混合樣本RNA、上游引物mecA-f、下游引物mecA-r、重組酶、聚合 酶、DNA結(jié)合蛋白、緩沖溶液和ddH20,得到反應(yīng)體系；
[0022] (3)震蕩混勻步驟(2)制得的反應(yīng)體系后，加入核酸內(nèi)切酶，再次震蕩混合均勻，于 37~42 °C下恒溫反應(yīng)，進(jìn)行RPA擴(kuò)增；
[0023] (4)檢測RPA擴(kuò)增后的產(chǎn)物。
[0024]重組酶聚合酶擴(kuò)增（Recombinase Polymerase Amplif ication，RPA)，是一種新型 的核酸擴(kuò)增檢測技術(shù)。與常規(guī)的PCR擴(kuò)增（必須經(jīng)過變性、退火、延伸三個步驟)相比，RPA反 應(yīng)只需要在37~42°C恒溫反應(yīng)30分鐘左右，即能夠?qū)⒑哿康暮怂崮０鍞U(kuò)增10 12倍，達(dá)到可以 檢出的水平，且RPA擴(kuò)增不需要溫控設(shè)備，可以真正實現(xiàn)便攜式的快速核酸檢測。RPA技術(shù)主 要依賴于三種酶:能結(jié)合單鏈核酸的重組酶、單鏈DNA結(jié)合蛋白和鏈置換DNA聚合酶。重組酶 與引物結(jié)合形成的蛋白-DNA復(fù)合物，能在雙鏈DNA中尋找同源序列，一旦引物定位了同源序 列，就會發(fā)生鏈交換反應(yīng)形成并啟動DNA合成，對模板上的目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行指數(shù)式擴(kuò)增。被替 換的DNA鏈與DNA結(jié)合蛋白結(jié)合，防止進(jìn)一步替換。在這個體系中，由兩個相對的引物起始一 個合成事件。整個過程進(jìn)行得非?？?，一般可在30分鐘之內(nèi)獲得可檢出水平的擴(kuò)增產(chǎn)物。 [0025]由于RPA反應(yīng)所需的三種酶的混合物在常溫下就有活性，往往混合過程中擴(kuò)增反 應(yīng)就開始了，導(dǎo)致反應(yīng)背景較高，甚至有非特異性擴(kuò)增出現(xiàn)。本發(fā)明使用將引物的3'末端封 閉掉，使擴(kuò)增反應(yīng)不能開始，混合完成后，再用核酸內(nèi)切酶切開THF位點，形成自由的3'末 端，開始擴(kuò)增反應(yīng)，提高了擴(kuò)增反應(yīng)的特異性和嚴(yán)謹(jǐn)性。
[0026] 作為本發(fā)明所述檢測耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的方法的優(yōu)選實施方式，所述步 驟（1)中，采用Trizo 1或RNA提取試劑盒提取樣本RNA;所述步驟(4)中，采用電泳法、試紙條 法、比濁法或熒光定量法等方法檢測RPA擴(kuò)增后的產(chǎn)物。
[0027] 本發(fā)明的有益效果為:本發(fā)明提供了一種用于耐甲氧西林金黃色葡萄球菌檢測的 引物，該引物特異性強(qiáng)、擴(kuò)增效率高，可有效、快速地檢測耐甲氧西林金黃色葡萄球菌。本發(fā) 明還建立了穩(wěn)定的RPA擴(kuò)增檢測MRSA的反應(yīng)體系，克服了 MRSA當(dāng)前臨床檢測的諸多問題，為 MRSA感染的診斷、預(yù)防和控制提供新的檢測方法。
[0028] 本發(fā)明采用重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)檢測耐甲氧西林金黃色葡萄球菌，靈敏度高、 特異性強(qiáng)、檢測速度快且無需專門儀器。
[0029]此外，本發(fā)明檢測的樣本廣