用于分析靶標(biāo)的方法和試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明涉及用于分析靶標(biāo)的方法和試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來，已經(jīng)嘗試使用包括與靶標(biāo)特異性結(jié)合的結(jié)合核酸分子（所謂的"適體 (aptamer)"）在內(nèi)的傳感器代替與靶標(biāo)特異性結(jié)合的抗體進(jìn)行靶標(biāo)檢測。作為這樣的傳感 器，例如，已經(jīng)報道了被配置為使得具有催化氧化還原反應(yīng)能力的DNA(在下文中被稱為 "DNA酶"）與結(jié)合核酸分子連接從而檢驗靶標(biāo)與結(jié)合核酸分子的結(jié)合的傳感器(非專利文獻(xiàn) 1)。在這種傳感器中，在不存在靶標(biāo)的情況下發(fā)生結(jié)合核酸分子和DNA酶的自結(jié)合，由此抑 制了 DNA酶的催化能力(OFF)。另一方面，在靶標(biāo)的存在下，自結(jié)合通過靶標(biāo)與適體的接觸而 釋放，由此活化了DNA酶的催化能力(0N)。因此，如果靶標(biāo)存在，其催化能力被活化的DNA酶 引起氧化還原反應(yīng)，從而可以通過測量反應(yīng)來間接地分析靶標(biāo)。
[0003] 然而，取決于存在或不存在靶標(biāo)，上述傳感器需要對在傳感器中使用的DNA酶的催 化能力的0N-0FF控制。此外，為了進(jìn)一步提高在使用傳感器的分析中的分析靈敏度，例如， 需要使用展現(xiàn)出更強(qiáng)催化能力的DNA酶。
[0004] 使用結(jié)合核酸分子（適體）的ELAA(酶聯(lián)適體測定（Enzyme-1 inked Aptamer Assay))是例如使用以生物素標(biāo)記的結(jié)合核酸分子的方法。在這種方法中，與鏈霉抗生物素 蛋白融合的酶，如辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶，與生物素標(biāo)記的核酸分子結(jié)合，并且通過 檢測酶的底物來分析靶標(biāo)與結(jié)合核酸分子的結(jié)合。然而，在ELAA中，結(jié)合核酸分子的標(biāo)記是 必需的，并且為了提高分析靈敏度，例如需要改善各種條件設(shè)置。
[0005] 如上所述，在使用上述傳感器的情況下，需要使各種改進(jìn)從而進(jìn)行更可靠的分析。
[0006] 這些情況下，存在對能夠使用結(jié)合核酸分子容易地檢測靶標(biāo)并且還能夠容易地提 高分析靈敏度的方法的需求。
[0007] 引用清單
[0008] 非專利文獻(xiàn)
[0009] [非專利文獻(xiàn) 1 ]Carsten Teller等人，Anal · Chem. 2009，81，pp · 9114-9119 [0010] 發(fā)明概述
[0011] 本發(fā)明要解決的問題
[0012] 考慮到前述內(nèi)容，本發(fā)明的目的是提供可以使用結(jié)合核酸分子容易地分析靶標(biāo)的 新方法以及用于在該方法中使用的分析試劑盒。
[0013]解決問題的手段
[0014]本發(fā)明提供用于分析靶標(biāo)的分析方法，其包括:使得與所述靶標(biāo)結(jié)合的結(jié)合核酸 分子與樣品彼此接觸以形成所述結(jié)合核酸分子與所述樣品中所述靶標(biāo)的復(fù)合物的復(fù)合物 形成步驟;通過核酸酶處理將核酸單體從復(fù)合物級分和非復(fù)合物級分中的至少一個釋放的 核酸酶處理步驟;使釋放的核酸單體與以所述核酸單體為底物的酶進(jìn)行反應(yīng)的酶處理步 驟;檢測所述酶反應(yīng)的檢測步驟;和根據(jù)檢測所述酶反應(yīng)的結(jié)果分析已經(jīng)形成了所述復(fù)合 物的所述靶標(biāo)的分析步驟。
[0015] 本發(fā)明還提供用于在根據(jù)本發(fā)明的分析方法中使用的分析試劑盒，其包括:與靶 標(biāo)結(jié)合的結(jié)合核酸分子;核酸酶;和以核酸單體為底物的酶。
[0016] 本發(fā)明的效果
[0017] 根據(jù)本發(fā)明的分析方法，可以通過下列方式容易地檢測靶標(biāo):形成靶標(biāo)和結(jié)合核 酸分子的復(fù)合物，將核酸單體從復(fù)合物級分或非復(fù)合物級分釋放，以及進(jìn)行與作為底物的 釋放的核酸單體的酶反應(yīng)。根據(jù)這種方法，例如，不必如上文所述的那樣使DNA酶與適體連 接，從而取決于存在或不存在靶標(biāo)的對DNA酶的催化能力的0N-0FF控制也不是必需的。此 外，根據(jù)本發(fā)明的分析試劑盒，能夠容易地進(jìn)行本發(fā)明的分析方法。因為本發(fā)明涉及使用適 體的靶標(biāo)檢測方法，可以認(rèn)為，例如，本發(fā)明是用于各種領(lǐng)域（如臨床醫(yī)療實踐、食品和環(huán) 境)中的研究和試驗的非常有用的技術(shù)。
[0018] 附圖簡述
[0019] [圖1]圖1是示出本發(fā)明的分析方法的一個實例的示意圖。
[0020] [圖2]圖2是示出本發(fā)明的分析方法的另一個實例的示意圖。
[0021] [圖3]圖3是示出本發(fā)明的分析方法的又一個實例的示意圖。
[0022] [圖4]圖4是示出本發(fā)明的分析方法的此外另一個實例的示意圖。
[0023][圖5]圖5是顯示實施例1中發(fā)光量的圖表。
[0024][圖6]圖6是顯示實施例2中發(fā)光量的圖表。
[0025][圖7]圖7是顯示實施例3中發(fā)光量的圖表。
[0026][用于實施本發(fā)明的方式]
[0027] 如上所述，本發(fā)明的分析方法是用于分析靶標(biāo)的分析方法，其包括:使得與所述靶 標(biāo)結(jié)合的結(jié)合核酸分子與樣品彼此接觸以形成所述結(jié)合核酸分子與所述樣品中所述靶標(biāo) 的復(fù)合物的復(fù)合物形成步驟;通過核酸酶處理將核酸單體從復(fù)合物級分和非復(fù)合物級分中 的至少一個釋放的核酸酶處理步驟;使釋放的核酸單體與以所述核酸單體為底物的酶進(jìn)行 反應(yīng)的酶處理步驟;檢測所述酶反應(yīng)的檢測步驟;和根據(jù)檢測所述酶反應(yīng)的結(jié)果分析已經(jīng) 形成了所述復(fù)合物的所述靶標(biāo)的分析步驟。
[0028] 本發(fā)明的分析方法可以被配置為使得:例如，其還包括，在所述復(fù)合物形成步驟之 后的將所述復(fù)合物級分和所述非復(fù)合物級分與用于所述復(fù)合物形成的反應(yīng)體系分離的分 離步驟。
[0029] 本發(fā)明的分析方法可以被配置為使得:例如，在所述分離步驟中，通過使得用于所 述復(fù)合物形成的所述反應(yīng)體系與固定的結(jié)合物質(zhì)彼此接觸以將所述復(fù)合物與所述結(jié)合物 質(zhì)結(jié)合，而將所述復(fù)合物級分和所述非復(fù)合物級分分離，并且所述結(jié)合物質(zhì)是與靶標(biāo)結(jié)合 的結(jié)合物質(zhì)。
[0030] 本發(fā)明的分析方法可以被配置為使得:例如，在所述分離步驟中，在所述復(fù)合物已 經(jīng)與所述結(jié)合物質(zhì)結(jié)合之后，洗滌所述固定的結(jié)合物質(zhì)以移除未反應(yīng)的結(jié)合核酸分子。 [0031 ]本發(fā)明的分析方法可以被配置為使得:例如，在所述核酸酶處理步驟中，對所述復(fù) 合物級分進(jìn)行所述核酸酶處理將所述核酸單體從所述復(fù)合物釋放。
[0032]本發(fā)明的分析方法可以被配置為使得:例如，在所述核酸酶處理步驟中，對所述非 復(fù)合物級分進(jìn)行所述核酸酶處理將所述核酸單體從未反應(yīng)的結(jié)合核酸分子釋放。
[0033] 本發(fā)明的分析方法可以被配置為使得:例如，所述結(jié)合核酸分子包含添加到其上 的多核苷酸，并且所述多核苷酸包含作為所述酶的底物的核酸單體。
[0034] 本發(fā)明的分析方法可以被配置為使得:例如，所述結(jié)合核酸分子負(fù)載在載體上。
[0035] 本發(fā)明的分析方法可以被配置為使得:例如，所述載體還包含添加到其上的多核 苷酸，并且所述多核苷酸包含作為所述酶的底物的核酸單體。
[0036] 本發(fā)明的分析方法可以被配置為使得:例如，在所述核酸酶處理步驟中，對所述復(fù) 合物形成步驟中的反應(yīng)體系進(jìn)行所述核酸酶處理以將所述核酸單體從未反應(yīng)的結(jié)合核酸 分子釋放。
[0037] 本發(fā)明的分析方法可以被配置為使得:例如，所述結(jié)合核酸分子是與單鏈核酸分 子的雜交體的形式，所述單鏈核酸分子包含與所述結(jié)合核酸分子互補(bǔ)的序列；在所述復(fù)合 物形成步驟中，使得所述雜交體和所述樣品彼此接觸以形成在所述雜交體中的所述結(jié)合核 酸分子與所述靶標(biāo)的復(fù)合物并且將所述單鏈核酸分子從所述雜交體釋放;并且在所述核酸 酶處理步驟中，對所述復(fù)合物形成步驟中的反應(yīng)體系進(jìn)行所述核酸酶處理以將所述核酸單 體從所述釋放的單鏈核酸分子釋放。
[0038] 本發(fā)明的分析方法可以被配置為使得:例如，所述結(jié)合核酸分子負(fù)載在載體上并 且是與單鏈核酸分子的雜交體的形式，所述單鏈核酸分子包含與所述結(jié)合核酸分子互補(bǔ)的 序列；在所述復(fù)合物形成步驟中，使得所述雜交體和所述樣品彼此接觸以形成在所述雜交 體中的所述結(jié)合核酸分子與所述靶標(biāo)的復(fù)合物并且將所述單鏈核酸分子從所述雜交體釋 放;并且在所述核酸酶處理步驟中，對所述復(fù)合物形成步驟中的反應(yīng)體系進(jìn)行所述核酸酶 處理以將所述核酸單體從所述釋放的單鏈核酸分子釋放。
[0039] 本發(fā)明的分析方法可以被配置為使得:例如，其還包括，在所述復(fù)合物形成步驟之 后的將所述釋放的單鏈核酸分子與所述復(fù)合物形成步驟中的反應(yīng)體系分離的分離步驟，并 且在所述核酸酶處理步驟中，對所述分離的單鏈核酸分子進(jìn)行所述核酸酶處理以將所述核 酸單體從所述單鏈核酸分子釋放。
[0040] 本發(fā)明的分析方法可以被配置為使得:例如，所述核酸酶是以所述單鏈核酸分子 為底物的核酸酶。
[0041 ]本發(fā)明的分析方法可以被配置為使得:例如，所述核酸酶是核酸外切酶。
[0042]本發(fā)明的分析方法可以被配置為使得:例如，作為所述酶的底物的所述核酸單體 是腺苷核苷酸，其可以是，例如，核糖核苷酸和脫氧核糖核苷酸中的至少一種。
[0043]本發(fā)明的分析方法可以被配置為使得:例如，所述酶是具有熒光素酶活性的蛋白 質(zhì)，并且其具體實例是熒光素酶。
[0044] 本發(fā)明的分析方法可以被配置為使得:例如，在所述酶處理步驟中，所述酶反應(yīng)在 試劑的存在下進(jìn)行，并且
[0045] 所述試劑是使得信號通過與以所述核酸單體為底物的酶反應(yīng)而產(chǎn)生的試劑，或者 是使得信號通過與以所述核酸單體為底物的酶反應(yīng)而消失的試劑。
[0046] 本發(fā)明的分析方法可以被配置為使得:例如，在所述檢測步驟中，檢測到通過所述 酶反應(yīng)產(chǎn)生的信號或通過所述酶反應(yīng)導(dǎo)致消失的信號。
[0047] 本發(fā)明的分析方法可以被配置為使得:例如，所述信號是光信號和電信號中的至 少一種。
[0048]本發(fā)明的分析方法可以被配置為使得:例如，所述載體是珠或平板。
[0049]本發(fā)明的分析試劑盒是，例如，用于在根據(jù)本發(fā)明的分析方法中使用的分析試劑 盒，其包括:與靶標(biāo)結(jié)合的結(jié)合核酸分子;核酸酶;和以核酸單體為底物的酶。
[0050] 本發(fā)明的分析試劑盒可以被配置為使得:例如，所述結(jié)合核酸分子包含添加到其 上的多核苷酸，并且所述多核苷酸包含作為所述酶的底物的核酸單體。
[0051] 本發(fā)明的分析試劑盒可以被配置為使得:例如，所述結(jié)合核酸分子負(fù)載在載體上。
[0052] 本發(fā)明的分析試劑盒可以被配置為使得:例如，所述載體還包含添加到其上的多 核苷酸，并且所述多核苷酸包含作為所述酶的底物的核酸單體。
[0053]本發(fā)明的分析試劑盒可以被配置為使得:例如，所述結(jié)合核酸分子是與單鏈核酸 分子的雜交體的形式，所述單鏈核酸分子包含與所述結(jié)合核酸分子互補(bǔ)的序列，并且通過 與所述靶標(biāo)接觸，所述雜交體中的所述結(jié)合核酸分子與所述靶標(biāo)形成復(fù)合物并且釋放所述