一種抗原多肽及由其構(gòu)建抗gbm腎炎模型的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明設(shè)及一種致病新抗原多膚及其用途，尤其設(shè)及Goodpasture病的一種致病 性抗原多膚P14及其在構(gòu)建抗GBM腎炎模型的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 抗腎小球基底膜(glomerular basement disease，GBM)病，是自身免疫功能素亂 的一組疾病。該病的特點(diǎn)是循環(huán)產(chǎn)生抗GBM抗體，在肺臟和/或腎臟沉積。累及腎臟形成新月 體腎炎，一方面表現(xiàn)為腎小球囊壁層上皮細(xì)胞顯著增生，堆積成層，在毛細(xì)血管叢周圍形成 的新月形小體，新月形小體主要由增生的壁層上皮細(xì)胞和滲出的單核細(xì)胞構(gòu)成，還可有中 性粒細(xì)胞和淋己細(xì)胞浸潤(rùn)，W上成分附著于球囊壁層，在毛細(xì)血管球外側(cè)呈新月狀或環(huán)狀 結(jié)構(gòu)分布；另一方面累及肺臟表現(xiàn)為彌漫性肺泡出血，肺和腎同時(shí)受累，稱為Goodpasture 病。該病進(jìn)展迅速，預(yù)后極差?？笹BM抗體識(shí)別的祀抗原是基底膜IV型膠原α3鏈的非膠原區(qū) 1，簡(jiǎn)稱為α3( IV)NC1，即Goodpasture抗原。該抗原由234個(gè)氨基酸組成，是具有復(fù)雜空間結(jié) 構(gòu)的蛋白質(zhì)分子，其中精確的誘導(dǎo)疾病發(fā)生的線性抗原決定簇并不明確。
[0003] 既往學(xué)者發(fā)現(xiàn)，Goo化as化re抗原上的線性膚段可W誘發(fā)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物產(chǎn)生抗GBM腎炎 模型。Chen L等人發(fā)現(xiàn)大鼠 a3NCl上第14-26位的氨基酸序列SQTTANPSC陽(yáng)GT，R巧nolds J等 人發(fā)現(xiàn)大鼠 Q3NC1上第10-23位的氨基酸序列FT畑SQTTANPSCP，均可W誘發(fā)WKY大鼠出現(xiàn)新 月體腎炎。Robertson J等人發(fā)現(xiàn)小鼠 a3NCl上位于第14-26位的氨基酸序列SQTTANPSCPEGT 可W誘發(fā)WKY大鼠出現(xiàn)新月體腎炎。Ooi JD等人在轉(zhuǎn)基因小鼠上，發(fā)現(xiàn)小鼠 Q3NC1上位于第 132-151位的氨基酸序列CPQDWVSLWKGFSFIMFTSA具有致腎炎作用。運(yùn)些研究為尋找抗GBM病 的起始的致病性線性抗原表位提供了重要證據(jù)。但是運(yùn)些序列均來(lái)自動(dòng)物，并不能真正反 映人類抗GBM病患者a3NCl上的致病性抗原表位。Luo AM等人曾嘗試用人類a3NCl上位于第 78-93位的氨基酸序列3帥￥0￥胖1^51?41^1?和位于第1 53-168位的氨基酸序列 SEGTGQALASPGS化E免疫WKY大鼠，僅有部分大鼠發(fā)生輕度的腎小球腎炎，不能產(chǎn)生典型的新 月體腎炎，因此并非Goodpasture抗原上理想的的致病性抗原表位。
[0004] 各種已報(bào)道的Goodpasture抗原的線性抗原多膚列舉如下：
[0005]
[0006] 截至目前，國(guó)際上尚沒有利用人類Goodpasture抗原上的線性膚段誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 發(fā)生抗GBM腎炎的成功方案。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)中已有的人源抗原序列只能引起大鼠輕度的腎小球腎炎而不 能誘導(dǎo)典型的Goodpasture病的癥狀，并且國(guó)內(nèi)外也缺乏人源抗原的高度模擬人類抗GBM腎 炎的動(dòng)物模型等問(wèn)題，本發(fā)明提供一種基于Goodpasture病的致病性抗原多膚及其在構(gòu)建 抗GBM腎炎模型的應(yīng)用。
[0008] 為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明一方面提供一種抗原多膚P14,具有Goodpasture病 的致病性，其致病活性位點(diǎn)氨基酸包括人類基底膜IV型膠原03鏈的非膠原區(qū)1的第136位色 氨酸W、第137位異亮氨酸I、第139位亮氨酸L和第140位色氨酸W。
[0009] 其中，所述抗原多膚P14的氨基酸序列為TDIPPCPHGWISLWKGFSFIMF，包括如上所述 的位于人類基底膜IV型膠原03鏈的非膠原區(qū)1的致病活性位點(diǎn)氨基酸。特別是，P14所示的 抗原多膚來(lái)源于人類基底膜IV型膠原村鏈的非膠原區(qū)l(a3(IV)NCl)的氨基酸序列。
[0010] 特別是，P14所示的抗原多膚可W誘發(fā)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物產(chǎn)生與人類抗GBM病表現(xiàn)一致的新 月體性腎小球腎炎。
[0011] 為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明另一方面提供Goodpasture病的一種抗原多膚在構(gòu) 建抗GBM腎炎模型的用途。
[0012] 為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明再一方面提供一種抗GBM腎炎模型從而研究 GoodpasUire病的發(fā)病機(jī)制。
[0013] 為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明再一方面提供一種抗GBM腎炎模型的構(gòu)建方法，其特 征在于，包括：
[0014] 1)將合成并純化后的Goodpasture病的抗原多膚與完全弗氏佐劑等體積混合，使 其充分乳化，制得該抗原多膚的免疫原；
[0015] 2)將制得的所述免疫原免疫動(dòng)物，獲得抗GBM腎炎初級(jí)模型；
[0016] 3)通過(guò)對(duì)獲得的抗GBM腎炎初級(jí)模型進(jìn)行鑒定，將具有Goodpasture病的病理癥狀 的抗GBM腎炎初級(jí)模型選作所述抗GBM腎炎模型。
[0017] 尤其是，所述合成并純化后的Goodpasture病的抗原多膚的活性片段P14,具有 Goo化as化re病的致病性，其致病活性位點(diǎn)氨基酸包括人類基底膜IV型膠原α3鏈的非膠原 區(qū)1的第136位色氨酸W、第137位異亮氨酸I、第139位亮氨酸L和第140位色氨酸W。
[0018] 優(yōu)選的，所述抗原多膚Ρ14的氨基酸序列為TDIPPCPHGWISLWKGFSFIMF。
[0019] 特別是，制備模型所選用的動(dòng)物為大鼠。
[0020] 尤其是，在構(gòu)建抗GBM腎炎模型中，在將制得的抗原多膚免疫原免疫動(dòng)物時(shí)采用免 疫方式是腹腔注射、肌肉注射和皮下注射中的一種或多種。
[0021 ]優(yōu)選地，在構(gòu)建抗GBM腎炎模型中，在將制得的抗原多膚免疫原免疫動(dòng)物時(shí)采用免 疫方式是腹腔注射。
[0022] 特別是，在構(gòu)建抗GBM腎炎模型中，將制得的抗原多膚免疫原免疫大鼠時(shí)只需采用 單次免疫。
[0023] 特別是，所述將制得的抗原多膚免疫原免疫大鼠的免疫劑量為0.67-2yg/g。
[0024] 優(yōu)選地，所述將制得的抗原多膚免疫原免疫大鼠的免疫劑量為1.3ug/g。
[0025] 尤其是，在抗原多膚免疫原免疫大鼠后第4至5周內(nèi)即出現(xiàn)Goodpasture病的臨床 和病理癥狀，得到抗GBM腎炎初級(jí)模型。
[0026] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：
[0027] 1、本發(fā)明是首次利用人類Goodpasture抗原的線性膚段成功誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物發(fā)生抗 GBM腎炎，該動(dòng)物模型出現(xiàn)嚴(yán)重的蛋白尿、水腫、腎功能受損，病理切片發(fā)現(xiàn)大量的新月體形 成，運(yùn)些臨床表現(xiàn)和發(fā)病機(jī)制都與人類抗GBM病高度一致，可W作為優(yōu)選的腎炎機(jī)制實(shí)驗(yàn)研 究的工具。
[0028] 2、本發(fā)明在構(gòu)建動(dòng)物模型中還發(fā)現(xiàn)大鼠體內(nèi)不僅存在識(shí)別抗原多膚的抗體，也存 在識(shí)別人類03NC1的抗體，腎臟洗脫液中還存在人類Q1-5NC1的抗體，證明免疫過(guò)程中發(fā)生 了分子內(nèi)和分子間的抗原表位擴(kuò)展，更加有利于腎炎機(jī)制實(shí)驗(yàn)的研究。
[0029] 3、本發(fā)明構(gòu)建的動(dòng)物模型高度模擬人類抗GBM腎炎，抗原制備簡(jiǎn)單，取材廉價(jià)，僅 需單次免疫，成功率高、重復(fù)性好，可成為研究自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制和干預(yù)治療的很 好的工具。
[0030] 4.本發(fā)明發(fā)現(xiàn)人Goodpasture抗原上第136位的色氨酸(W)、第137位的異亮氨酸 (I)、第139位的亮氨酸化)和第140位的色氨酸(W)是P14上的關(guān)鍵氨基酸，不僅為抗GBM病病 因?qū)W的研究打下了基礎(chǔ)，而且根據(jù)致病位點(diǎn)的氨基酸性質(zhì)將可能開發(fā)出針對(duì)抗GBM腎炎的 特異性的預(yù)防和治療手段。
【附圖說(shuō)明】
[0031] 圖1是本發(fā)明實(shí)施例1中抗原多膚P14的HPLC純化結(jié)果圖；
[0032] 圖2是本發(fā)明實(shí)施例1中抗原多膚P14的質(zhì)譜分析結(jié)果圖；
[0033] 圖3是本發(fā)明實(shí)施例2中免疫原免疫大鼠后的血肌酢檢測(cè)結(jié)果圖，A圖為血肌酢濃 度水平與時(shí)間關(guān)系的折線圖，B圖是血肌酢濃度水平的散點(diǎn)分布圖；
[0034] 圖4是本發(fā)明實(shí)施例2中免疫原免疫大鼠后的血尿素氮檢測(cè)結(jié)果圖，A圖為血尿素 氮濃度水平與時(shí)間關(guān)系的折線圖，B圖是尿素氮濃度水平的散點(diǎn)分布圖;血漿生化檢測(cè)和尿 蛋白檢測(cè)結(jié)果圖；
[0035] 圖5是本發(fā)明實(shí)施例2中免疫原免疫大鼠后的尿蛋白水平檢測(cè)結(jié)果圖，A圖為尿蛋 白濃度水平與時(shí)間關(guān)系的折線圖，B圖是尿蛋白濃度水平的散點(diǎn)分布圖；
[0036] 圖6是本發(fā)明實(shí)施例3中免疫原免疫大鼠后光鏡下腎臟的病理檢測(cè)結(jié)果圖，其中A 圖是陽(yáng)性對(duì)照組，B圖是P14處理組，C圖是陰性對(duì)照組，D圖是陽(yáng)性對(duì)照、P14處理組和陰性對(duì) 照組新月體比例的比較統(tǒng)計(jì)圖；
[0037] 圖7是本發(fā)明實(shí)施例3中免疫原免疫大鼠后巧光顯微鏡下腎臟組織上IgG的沉積檢 巧幡果圖，其中A圖是陽(yáng)性對(duì)照?qǐng)D，B圖是P14處理組，C圖是陰性對(duì)照組；
[0038] 圖8是本發(fā)明實(shí)施例3中在電鏡下觀察處理組新月體形成后的結(jié)果圖，箭頭所指方 向?yàn)樾略麦w；
[0039] 圖9是本發(fā)明實(shí)施例4中在免疫原免疫大鼠后循環(huán)中的抗體檢測(cè)結(jié)果圖。其中，圖A 為P14組大鼠循環(huán)中識(shí)別P14W及α1-α5的抗體檢測(cè)結(jié)果圖；圖B為P14抗體和α3抗體之間的 交叉抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖；圖C為Ρ14組大鼠腎臟洗脫液中識(shí)別P14W及α1-α5的抗體檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié) 果圖。
[0040] 圖10是Ρ14上的氨基酸進(jìn)行逐一替換后，膚段的致病作用。Α:尿蛋白；Β:血肌酢;C: 血尿素氮;D:腎臟形成新月體的腎小球百分比。紅色線是根據(jù)正常對(duì)照組大鼠得到的cut? off 值
[0041] 圖11是大鼠循環(huán)抗體對(duì)替換后免疫膚段及a3(IV)NCl的識(shí)別。A:用替換掉第136位 色氨酸(W)的P14膚段免疫大鼠，可W產(chǎn)生針對(duì)該膚段的抗體但沒有抗α3(IV)NCl的抗體;B: 用替換掉第137位異亮氨酸（I)的P14膚段免疫大鼠，可W產(chǎn)生針對(duì)該膚段的抗體但沒有抗α 3(IV)NCl的抗體;C:用替換掉第139位的亮氨酸化)的Ρ14膚段免疫大鼠，可W產(chǎn)生針對(duì)該膚 段的抗體但沒有抗a3(IV)NCl的抗體;D:用替換掉第140位的色氨酸(W)