抗人肺炎鏈球菌fam2家族PspA蛋白抗體及應(yīng)用該抗體的免疫層析試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，設(shè)及抗人肺炎鏈球菌fam2家族PspA蛋白抗體及應(yīng) 用該抗體檢測人肺炎鏈球菌的免疫層析試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 人肺炎鏈球菌（Sheptococcus pneumoniae，Sp)是兒童呼吸道感染的重要病原 體。主要經(jīng)飛沫傳播而進(jìn)入呼吸道，從而寄生于人體的鼻咽部，或侵入人體不易清除的部位 引起一系列的疾病，如大葉性肺炎，腦膜炎，支氣管炎，中耳炎等。它是全球所有年齡組高發(fā) 病率和病死率的主要病原菌。其中，在發(fā)展中國家，嬰幼兒、老年人及免疫缺陷人群中尤為 嚴(yán)重。肺炎鏈球菌于1881年首次由己斯德化ouis化steur)及G.M.Sternberg分別在法國及 美國從患者疲液中分離出。其為革蘭氏染色陽性，菌體似矛頭狀，成雙或成短鏈狀排列的雙 球菌，有毒株菌體外有化學(xué)成分為多糖的芙膜。其芙膜具有抗原性，是肺炎鏈球菌分型的依 據(jù)。根據(jù)芙膜多糖抗原性的不同將肺炎球菌分為91個(gè)血清型。其菌體抗原主要為C多糖，其 存在于肺炎鏈球菌細(xì)胞壁中，具有種特異性，為各型菌株所共有。C多糖可被血清中C-反應(yīng) 蛋白沉淀。在巧離子存在時(shí)，C多糖可與正常人血清中稱為C-反應(yīng)蛋白（C reactive protein，CRP)的防求蛋白結(jié)合，發(fā)生沉淀。目前針對人肺炎鏈球菌抗原的檢測亦主要是針對 此抗原，而該抗原非肺炎鏈球菌獨(dú)有，如緩和鏈球菌亦含有該抗原。并且C多糖的提純過程 困難，造成生產(chǎn)成本較高。在肺炎鏈球菌表面還有一種與毒力相關(guān)的重要抗原，為肺炎鏈球 菌表面蛋白A(PspA)，其存在于所有肺炎鏈球菌血清型中，是肺炎鏈球菌的特異性抗原。 PspA分為3個(gè)家族，其中具有fami或fam2家族PspA蛋白的人肺炎鏈球菌占到了臨床分離的 人肺炎鏈球菌種類的99 % W上。
[0003] 臨床病人由于不同的呼吸道病原體(如肺炎支原體、流感嗜血桿菌、流感病毒、呼 吸道合胞病毒、腺病毒等)感染引起疾病癥狀可W十分相似，運(yùn)導(dǎo)致了流行診斷比較困難， 確診往往依賴于實(shí)驗(yàn)室診斷?？焖儆行У脑\斷方法應(yīng)該是在疾病的發(fā)病初期就可W得到明 確的診斷，便于實(shí)施針對性的治療，阻止病情的發(fā)展遷延。
[0004] 盡管肺炎鏈球菌在全球范圍內(nèi)傳播，嬰幼兒的感染尤其普遍，但可用于實(shí)驗(yàn)室診 斷的標(biāo)準(zhǔn)化商品試劑的種類極少。目前，肺炎鏈球菌的檢測主要有W下幾種方法：
[0005] -、常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢測
[0006] 1、細(xì)菌分離
[0007] 實(shí)驗(yàn)室診斷肺炎鏈球菌的金標(biāo)準(zhǔn)是分離人肺炎鏈球菌毒株。采用鼻咽分泌物作為 病原體分離的標(biāo)本，可W用血培養(yǎng)的方法分離病原體。但是該法有嚴(yán)重的缺陷，因?yàn)榉窝祖?球菌是苛養(yǎng)菌，營養(yǎng)要求高，培養(yǎng)所需時(shí)間長，陽性率低，更重要的是，若采樣前患者使用過 抗菌藥物，會(huì)造成培養(yǎng)結(jié)果的假陽性。運(yùn)樣在臨床方面對病人的治療就有一定的局限性。 [000引 2、血清學(xué)檢測
[0009]即采用酶聯(lián)免疫法、放免法、微量免疫巧光法等，檢測被檢者血清中肺炎鏈球菌抗 體水平，可間接提示肺炎鏈球菌感染的存在。然而，血清學(xué)試驗(yàn)只能提供一種回顧性的診 斷，它需要同時(shí)檢測患者急性期和恢復(fù)期的雙份血清，如果恢復(fù)期中抗人肺炎鏈球菌抗體 效價(jià)比急性期高4倍或4倍W上才有診斷意義。另外，抗體出現(xiàn)的時(shí)機(jī)不易掌握，且因?yàn)榫w 血清型種類過多，導(dǎo)致其誘生的抗芙膜多糖抗體種類過多，對抗體的檢測造成了很大的困 難，故現(xiàn)有血清學(xué)方法的檢測質(zhì)量受到一定限制。
[0010] 二、快速診斷
[0011] 直接檢查人肺炎鏈球菌蛋白抗原和菌體核酸可達(dá)到快速診斷的目的，目前主要有 免疫巧光法、免疫酶法和PCR法等。免疫巧光法和免疫酶法均不能進(jìn)行一步檢測，均存在操 作步驟復(fù)雜，需要專業(yè)人員操作，檢測時(shí)間長(2hW上），成本較高等缺點(diǎn)。PCR方法快速、靈 敏、特異，是目前研究肺炎鏈球菌感染的重要手段，但由于PCR對實(shí)驗(yàn)設(shè)備W及操作要求較 高，且易出現(xiàn)假陽性，在我國還不能作為常用的臨床診斷方法。目前，檢測人肺炎鏈球菌抗 原的方法主要為膠體金法檢測其C多糖抗原，但是該法敏感度較低，對待檢樣品材料質(zhì)量要 求較高，同時(shí)還存在與其他鏈球菌如緩和鏈球菌存在交叉反應(yīng)等缺陷。PspA蛋白則是一個(gè) 極具特異性的檢測標(biāo)的。目前，關(guān)于抗人肺炎鏈球菌PspA蛋白抗體報(bào)道得最多的為相應(yīng)的 多克隆抗體。多克隆抗體主要由基因工程表達(dá)的PspA蛋白免疫家兔等動(dòng)物制備而成。其制 備方法簡單，成本低，但是其具有特異性低、效價(jià)低、純度低等缺陷。因此，低成本的制備高 特異性、高效價(jià)的抗人肺炎鏈球菌PspA蛋白抗體就顯得十分重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 針對【背景技術(shù)】中存在的運(yùn)些技術(shù)問題，本發(fā)明的目的在于提供識(shí)別人肺炎鏈球菌 fam2家族PspA蛋白34-47位W及274-287位氨基酸所組成的兩個(gè)線性抗原表位的兩種抗體 及應(yīng)用該抗體的免疫層析試劑盒。
[OOU]抗人肺炎鏈球菌fam2家族PspA蛋白抗體，其特征在于:所述抗人肺炎鏈球菌fam2 家族PspA蛋白抗體是分別識(shí)別人肺炎鏈球菌fam2家族PspA蛋白34-47位W及274-287位氨 基酸所組成的兩個(gè)線性抗原表位的兩種抗體，所述人肺炎鏈球菌fam2家族PspA蛋白在 GenBank序列號(hào)是WP_054380072.1;所述人肺炎鏈球菌f am2家族PspA蛋白34-47位的14個(gè)氨 基酸W及274-287位的14氨基酸的氨基酸序列分別為SPQW邸SSLEKKY及KLLD化DPEGKT孤； 將人肺炎鏈球菌fam2家族PspA蛋白34-47位的14個(gè)氨基酸W及274-287位的14氨基酸的序 列分別命名為F2P1及F2F2P2;所述抗人肺炎鏈球菌fam2家族PspA蛋白抗體是AbF2Pl W及 AbF2P2。
[0014] -種基于如前所述的抗人肺炎鏈球菌fam2家族PspA蛋白抗體所形成的免疫層析 試劑盒，其特征在于:所述試劑盒是基于量子點(diǎn)標(biāo)記技術(shù)的免疫層析試劑盒或基于膠體金 標(biāo)記技術(shù)的免疫層析試劑盒。
[0015]作為優(yōu)選，本發(fā)明所提供的試劑盒是基于量子點(diǎn)標(biāo)記技術(shù)的免疫層析試劑盒時(shí)， 所述試劑盒的制備方法是：
[0016] 1)量子點(diǎn)標(biāo)記抗體AbF2Pl溶液：
[0017] 向微量離屯、管中依次加入0.4nmol簇基水溶性量子點(diǎn)和SOOnmol碳二亞胺抓C，W MES緩沖液定容為1ml，混合溶液，37°C反應(yīng)5min后，再加入0.4mg的制備得到的抗體AbF2Pl， 避光反應(yīng)化，加入單端氨基聚乙二醇陽G2000-NH2至終濃度為l%(m/v)，封閉未反應(yīng)的活化 簇基位點(diǎn)，繼續(xù)避光反應(yīng)化；反應(yīng)后的樣品用超濾管離屯、（截留分子量100k)，6500g離屯、 5min，至體積200ul，將超濾后樣品轉(zhuǎn)移至普通EP管內(nèi)，離屯、除團(tuán)聚，得到上部清液W及下部 沉淀，lOOOOg條件下離屯、3min;將上部清液加到分離柱Superdex-200上純化，待上部清液自 然流入柱體中，然后用PBS沖洗，用紫外光照射柱體觀察樣品的位置，待樣品開始從下部流 出時(shí)開始收集，收集1ml后停止收集;將純化后的樣品用超濾管（截留分子量100k) W6500g 離屯、濃縮至200ul后轉(zhuǎn)移至普通EP管內(nèi)離屯、除團(tuán)聚，對普通EP管進(jìn)行離屯、的條件是lOOOOg， 3min;獲取上清后W憐酸鹽保存液稀釋200倍，4°C保存?zhèn)溆?；至此制得量子點(diǎn)標(biāo)記抗體 AbF2Pl 溶液；
[0018] 所述MES緩沖液中各組分含量分別是：10.66g/L MESW及0.74g/L EDTA，所述MES 緩沖液的抑7.4;
[0019] 所述憐酸鹽保存液的制備方式是稱取0.29g憐酸氨二鋼、0.0295g憐酸二氨鋼、 0.2g氯化鋼、Ig牛血清白蛋白BSA W及0.1 g化N3，溶解于90ml的去離子水中，用Imol/L NaOH 調(diào)pH至7.3后用去離子水定容至100ml;
[0020] 2)制備結(jié)合墊
[0021] 將聚醋纖維膜浸入步驟1)所得到的量子點(diǎn)標(biāo)記抗體AbF2Pl溶液中化，取出，25°C 干燥后裁成后規(guī)格為4cm X 0.6cm/條后，4°C密封保存?zhèn)溆?，至此制得結(jié)合墊；
[0022] 3)制備樣品墊
[0023] 取玻璃纖維素膜一張，將玻璃纖維素膜在樣品墊處理液中浸泡至少化，再置于生 物安全柜內(nèi)37°C通風(fēng)干燥后，剪裁成規(guī)格為4cmX2.5cm/條后，即制得樣品墊，25°C密封保 存；
[0024] 所述樣品墊處理液的制備方式是稱取0.29g憐酸氨二鋼、0.0295g憐酸二氨鋼、 0.2g氯化鋼、2g牛血清白蛋白BSA、1ml吐溫-20、2g薦糖W及0.5g聚乙締化咯燒酬P(guān)VP-10，溶 解于90ml的去離子水中，用Imol/L NaOH調(diào)抑至7.3后用去離子水定容至100ml;
[00巧]4)制備檢測層
[0026] 將硝酸纖維素膜剪成4cm X 4cm大小；將制備得到的抗體AbF2P2和羊抗兔IgG用憐 酸鹽緩沖液調(diào)整至終濃度分別為2.0mg/mL及1.〇111旨/1^;將稀釋好的抗體AbF2P2裝入BI0D0T 劃膜儀噴頭中，設(shè)置1.化1/cm的量噴于硝酸纖維素膜上，形成檢測線;將稀釋好的抗兔IgG 裝入BI0D0T劃膜儀噴頭中，設(shè)置1.化1/cm的量噴于硝酸纖維素膜上作為質(zhì)控線，質(zhì)控線與 檢測線間距為0.7cm;將噴好的硝酸纖維素膜37°C干燥化，剪裁成4cmX4cm的規(guī)格，4°C密封 干燥保存;至此制得檢測層；
[0027] 所述憐酸鹽緩沖液的制備方式是:稱取0.29g憐酸氨二鋼、0.0295g憐酸二氨鋼W 及0.2g氯