一種高分子蒙脫石載菌凝膠球的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種高分子水凝膠球的制備方法，屬于生物化工和環(huán)保功能材料領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]固定化細(xì)胞的應(yīng)用極其廣泛，目前該技術(shù)己經(jīng)普遍應(yīng)用于工業(yè)、醫(yī)療診斷、化學(xué)分析、環(huán)境保護(hù)、能源開發(fā)與相關(guān)理論研究等多個(gè)領(lǐng)域。一個(gè)理想的固定化微生物材料要基本具備以下條件:(I)密集微生物，維持反應(yīng)器中的生物量濃度；(2)載體具有較高的機(jī)械強(qiáng)度，傳質(zhì)阻力??；(3)載體可再生，并可重復(fù)使用；(4)載體價(jià)格低廉，固定化方法費(fèi)用低；
(5)載體與微生物的固定結(jié)合強(qiáng)度高，能耐水力波動(dòng)的沖擊；(6)載體對(duì)微生物無毒，能抗微生物分解。
[0003]常用的固定化材料包括無機(jī)載體、有機(jī)高分子載體、復(fù)合載體等多種類型。無機(jī)載體具有機(jī)械強(qiáng)度大、對(duì)微生物無毒性、不易被微生物分解、耐酸堿、成本低、壽命長等特性。蒙脫石屬于天然無機(jī)載體，為蒙皂石族單斜晶系，TOT型，其單位晶胞是由兩層S1-O四面體夾一層Al-O八面體構(gòu)成，晶格置換、破鍵、八面體片層解離等因素都會(huì)導(dǎo)致蒙脫石具有電負(fù)性，使蒙脫石易于吸附帶正電荷的有機(jī)陽離子。此外，蒙脫石還具有較大的比表面積、優(yōu)良的吸附特性、良好的納米空間結(jié)構(gòu)，這使它在作為固定化細(xì)胞載體等方面的應(yīng)用具有更多的優(yōu)越性。但是無機(jī)載體固定化細(xì)胞時(shí)，主要靠吸附作用和電荷效應(yīng)(范德化力、氫鍵及靜電作用)，細(xì)胞結(jié)合不牢固，容易脫落。
[0004]有機(jī)高分子載體中的天然高分子凝膠載體一般具有生物相容性好、制備工藝簡單、傳質(zhì)性能好等優(yōu)點(diǎn)。常見的天然高分子凝膠有瓊脂、角叉萊膠、海藻酸鈣、甲殼素等。在這幾種天然載體中，瓊脂強(qiáng)度最差，角叉萊膠價(jià)格較貴，甲殼素不溶于普通試劑。相比之下，海藻酸鈣具有價(jià)格低廉、制備容易、傳質(zhì)性能好等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用最為廣泛。但海藻酸鈉強(qiáng)度較低，在厭氧條件下易被微生物分解，壽命較短。由于有機(jī)和無機(jī)載體材料各有其優(yōu)缺點(diǎn)，而兩類材料在許多方面互補(bǔ)。因此，可將這兩類材料結(jié)合在一起，組成復(fù)合載體材料，以改進(jìn)材料的性能。
[0005]包埋法是將微生物限定在凝膠的微小格子或微膠囊等有限空間內(nèi)，同時(shí)能讓基質(zhì)滲入和產(chǎn)物擴(kuò)散出來。包埋法對(duì)微生物活性影響小、顆粒強(qiáng)度高，是目前研究最多的固定化方法。交聯(lián)法是通過微生物與具有兩個(gè)或兩個(gè)以上的官能基團(tuán)的試劑反應(yīng)，使微生物菌體相互連接成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，而達(dá)到固定微生物的目的。在包埋過程中讓天然有機(jī)高分子發(fā)生交聯(lián)，會(huì)使高分子凝膠更加穩(wěn)定、堅(jiān)固。雖然，固定化微生物細(xì)胞的凝膠基質(zhì)可以防止細(xì)胞的泄漏，但同時(shí)也是底物和氧分子擴(kuò)散的屏障。擴(kuò)散阻礙會(huì)引起表觀反應(yīng)速率的下降。有時(shí)，甚至?xí)捎谫|(zhì)量傳遞限制而改變包埋固定在凝膠顆粒中細(xì)胞的代謝行為。因此，在固定化細(xì)胞動(dòng)力學(xué)研究過程中應(yīng)考慮凝膠內(nèi)物質(zhì)的擴(kuò)散行為。同時(shí)，顆粒的完整性受其機(jī)械強(qiáng)度、相互碰撞、摩擦和剪切力的影響，這些因素都會(huì)導(dǎo)致顆粒破裂。因此，包埋顆粒的機(jī)械強(qiáng)度和耐久性也是固定化微生物操作是否成功的關(guān)鍵。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]包埋載體應(yīng)具備對(duì)微生物無毒，制備容易，傳質(zhì)性能好，價(jià)格便宜等特點(diǎn)，海藻酸鈉作為載體具有操作方便，包埋微生物的活性高。明膠是一種常用的蛋白質(zhì)膠凝劑，溶解性好而且價(jià)格低廉，可以很好的改善海藻酸鈉的成型效果。利用海藻酸鈉與明膠聯(lián)合固定化制備的膠粒與單一的應(yīng)用海藻酸鈉相比可以提供更大的固定化空間，有利于物質(zhì)的擴(kuò)散。蒙脫石結(jié)構(gòu)特征決定其層間域具有優(yōu)良的離子交換性能和分子吸附特征。將海藻酸鈉、明膠與蒙脫石一起制備凝膠小球，可以解決蒙脫石在水中具有的分散懸浮性強(qiáng)、固液分離速度慢、絮凝物脫水效果差、不易分離等缺點(diǎn)。
[0007]稱取適量海藻酸鈉置于沸水中攪拌使其充分溶解，冷卻至室溫，配制濃度為5.0%的海藻酸鈉母液；稱取適量明膠置于沸水中攪拌使其充分溶解，冷卻至室溫，配制濃度為30.0%的明膠母液；取適量配制好的明膠母液、海藻酸鈉母液，加入適量蒙脫石及蒸餾水混合均勻，使海藻酸鈉濃度為1_4%，明膠濃度為0.5-3%，蒙脫石濃度為0.02-0.lg/mL，混合溶液體積為5-20mL。通過注射器(針頭型號(hào)22-27G)的針頭將上述混合液以5cm高度注入30mL含有濃度為0.4-0.7%的戊二醛及濃度為3_6%的氯化鈣混合溶液中，立即形成光滑的微球體。將此固定化小球在上述溶液中靜置3-10h，倒掉混合溶液，用適量蒸餾水洗滌小球兩次，備用。
[0008]向上述制得的小球中加入30mL蒸餾水后，再加入500 μ L濃度為0.2%的次甲基藍(lán)溶液，30 0C, 130rpm屏幕振蕩40min后取出溶液,用可見分光光度計(jì)測定其在620nm波長下的吸光度。吸光度值越小，說明其傳質(zhì)性能越好。蒙脫石的用量選定為:0.02、0.04、0.06、0.08,0.lg/mL (此時(shí)明膠濃度固定為3%，海藻酸鈉濃度固定物1%)，OD620從0.684下降到
0.071。使用Folin酚法測定上清液中的蛋白質(zhì)含量，蒙脫石濃度為0.lg/mL時(shí)，上清液中蛋白質(zhì)含量最低。明膠濃度選定為:3%、5%、7%、9%、11%(此時(shí)蒙脫石濃度固定為0.08 g/mL，海藻酸鈉濃度固定物1%)，0D62。從1.215下降到0.061 ;使用Folin酚法測定上清液中的蛋白質(zhì)含量，明膠濃度為3%時(shí)，上清液中蛋白質(zhì)含量最低。當(dāng)海藻酸鈉濃度選定為:1.0%、1.5%、
2.0%、2.5%、3.0%(此時(shí)明膠濃度固定為3%，蒙脫石濃度固定物0.08 g/mL)，OD620從0.196下降到0.096。使用Folin酚法測定上清液中的蛋白質(zhì)含量，海藻酸鈉濃度為3%時(shí)，上清液中蛋白質(zhì)含量最低。
[0009]取上述不同條件下制備的固定化小球置于30mL蒸餾水中，用磁力攪拌器以30°C、最大轉(zhuǎn)速進(jìn)行攪拌振蕩，2h后測量溶液在660nm處的吸光值，吸光值越小，說明機(jī)械強(qiáng)度越大。經(jīng)過測定其0D66。約為0.006-0.025，小球破碎率0-5%。
【具體實(shí)施方式】
[0010]具體實(shí)施例一
從冰箱中取出大腸桿菌JM109，取其中20 μ L接入到10mL的LB培養(yǎng)基中，37 °C、140rpm搖床培養(yǎng)48h。取上述LB培養(yǎng)基80毫升,于離心機(jī)4000r/min,離心15min,用生理鹽水洗滌菌體兩次。將上述離心分離得到的菌團(tuán)的一部分加入到1mL含海藻酸鈉、明膠、蒙脫石的液體中，使海藻酸鈉終濃度為4%，明膠終濃度為3%