一株高效降解瓊膠多糖的海洋桿菌的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及微生物領(lǐng)域，特別是設(shè)及一種能夠高效降解瓊膠多糖的海洋桿菌屬細 困。
【背景技術(shù)】
[0002] 瓊膠是江萬、石花菜等大型經(jīng)濟紅藻中的主要組成成分，被廣泛應用于生化、臨 床、醫(yī)藥和食品等領(lǐng)域。但瓊膠（多糖）需要特異性酶進行降解的特性成為阻礙大型經(jīng)濟海 藻進一步高值化和能源化利用的瓶頸。
[0003] 瓊膠酶是一類可特異性降解瓊膠多糖的酶，目前已發(fā)現(xiàn)的瓊膠酶根據(jù)其酶解糖巧 鍵的不同，主要分為α-瓊膠酶(作用位點為α-1，3糖巧鍵)和β-瓊膠酶(作用位點為β-1，4糖 巧鍵)兩類。根據(jù)瓊膠酶序列和功能分析結(jié)果可將其分為六大類glycosidic hydrolase (細)family,分別為細16、G冊0、細86、G朋6、細117和細118.其中細9巧日細117類瓊膠酶為α- 瓊膠酶，其酶解產(chǎn)物為瓊膠四糖、瓊膠六糖或D-galactose和3,6-anhy化oA-galactose;其 它類瓊膠酶皆為β-瓊膠酶，其酶解產(chǎn)物為新瓊十糖、新瓊八糖、新瓊六糖、新瓊四糖和新瓊 二糖。不同微生物的瓊膠酶酶解產(chǎn)生的瓊膠寡糖不同，有的是單一的寡糖，有的則是兩種寡 糖的混合物。
[0004] 目前糖生物學及糖化學領(lǐng)域的研究表明海藻低聚糖具有許多良好的生物學活性， 在新藥和保健品開發(fā)等領(lǐng)域具有廣泛的應用價值。在海藻低聚糖的制備方面，瓊膠低聚糖 的特異性酶降解制備法因效率高、專一性強、反應條件溫和作用時間短等優(yōu)勢成為近年來 的主要研究方向，但由于特異性瓊膠酶目前仍存在產(chǎn)量低、分離難度大、低聚糖產(chǎn)生量低等 問題，使其在工業(yè)生產(chǎn)中的應用受到了限制。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種能夠高效降解瓊膠多糖的海洋桿菌，W及利用該菌株制 備瓊膠酶和瓊膠寡糖的方法。
[0006] 本發(fā)明提供一株能夠高效降解瓊膠多糖的海洋桿菌菌株G4,該菌株為 Marinobacter adhaerens，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、 (CGMCC)，地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路巧院3號，中國科學院微生物研究所，郵編：100101, 保藏編號:CGMCC No.11016,保藏日期:2015年6月24日。
[0007] 該海洋桿菌篩選自富含瓊膠的大型野生海藻藻體，依次經(jīng)過篩選源(藻體)的富集 培養(yǎng)、菌群的馴化培養(yǎng)、單菌落的分離步驟，W及菌株的反復分離純化步驟后獲得。該海洋 桿菌為革蘭氏陰性，細胞外部形態(tài)呈短桿狀（圖1)，其leSrDNA序列見序列表1，圖2為根據(jù) leSrDNA序列構(gòu)建的海洋桿菌G4及其相關(guān)種的系統(tǒng)發(fā)育樹。該菌株具有穩(wěn)定高產(chǎn)β-瓊膠酶 的能力，能夠高效降解瓊膠多糖，生成新瓊四糖。菌株在221犯固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)4她后即可 在瓊脂平板上形成明顯凹陷，用盧戈氏艦液對瓊脂平板染色，可清晰反襯出凹陷的淺色或 無色的溶解圈或液化圈（圖3)。
[0008] 本發(fā)明還提供一種利用所述海洋桿菌G4制備β-瓊膠酶粗酶的方法。具體如下：
[0009] (1)將活化的海洋桿菌G4接種至添加有微生物生長所必需的碳源和氮源的海水中 培養(yǎng)數(shù)天；
[0010] (2)收集菌液，離屯、后取上清液，采用(NH4)2S化鹽析沉淀法提取胞外蛋白，為使蛋 白充分沉淀，可將上清液低溫靜置過夜后再離屯、收集蛋白沉淀；
[0011] (3)將獲得的蛋白沉淀用中性緩沖液復溶，即獲得含有β-瓊膠酶的粗酶液。
[0012] 為了提高細菌生物量，獲得更好的培養(yǎng)效果，上述步驟（1)中所述添加有微生物生 長所必需的碳源和氮源的海水優(yōu)選2216Ε海水培養(yǎng)基;進一步地，培養(yǎng)基中可含有0.07 %~ 0.15% (w/v)的瓊脂，瓊脂可起到誘導作用，在一定程度上提高產(chǎn)酶量。另外，上述步驟（1) 中的培養(yǎng)溫度為25~35 °C，培養(yǎng)方式優(yōu)選振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)時間至少為4她。
[OOU]上述步驟(2)中用于沉淀胞夕陸白的所述(馳)2S〇4的飽和度為65~80%。
[0014]上述步驟(3)中用于蛋白沉淀復溶的中性緩沖液優(yōu)選pH6~8的PBS憐酸緩沖液或 Tris-HCl緩沖液。
[001引為了獲得進一步濃縮的粗酶液，同時充分去除溶液中的(畑4佔0曲提高酶活性， 所述β-瓊膠酶粗酶的制備方法還包括后續(xù)步驟(4):使用截留分子量> 10KD的超濾離屯、管 對由上述步驟(3)獲得的粗酶液進行離屯、濃縮。優(yōu)選采用型號為U1化a-15的超濾離屯、管(截 留分子量為10KD)進行離屯、濃縮，離屯、濃縮時的離屯、力為4000~5000g。
[0016] 上述步驟(2)或步驟(3)獲得的粗酶液可通過低溫冷凍干燥處理形成蛋白粉末，W 便于使用或凍存。
[0017] 本發(fā)明還提供一種利用所述海洋桿菌G4產(chǎn)β-瓊膠酶粗酶制備新瓊四糖的方法。 具體如下：（1)將0-瓊膠酶粗酶和瓊脂底物加入抑6~8的憐酸鹽緩沖液中，30~40°C下恒溫 反應至少24h; (2)加入適量體積比為25:24:1的酪/氯仿/異戊醇，振蕩混勻，W去除反應后 溶液中殘留的蛋白質(zhì)；（3)將溶液離屯、至液面出現(xiàn)分層，吸取最上層清液，加入乙醇W促使 寡糖產(chǎn)物沉淀，最后離屯、收集沉淀。μπι
[0018] 上述步驟(3)中，用于促使寡糖沉淀的乙醇在上清液中的終濃度W70%~90% (ν/ V)為宜，最后離屯、收集沉淀時的離屯、力為lOOOOg。
[0019] 本發(fā)明的有益效果在于：提供了一株海洋桿菌Marinobacter adhaerens CGMCC No. 11016，該菌株具有穩(wěn)定高產(chǎn)β-瓊膠酶的能力，能夠高效降解瓊膠多糖，生成新瓊四糖； 經(jīng)過4她馴化培養(yǎng)后的菌株G4菌液，其上清液的酶活可達323.48U/mL。通過所述海洋桿菌G4 可快速、簡便地制備β-瓊膠酶粗酶，并且利用獲得β-瓊膠酶粗酶可快速、專一地制備新瓊四 糖。
【附圖說明】：
[0020] 圖1海洋桿菌G4經(jīng)革蘭氏染色后的光鏡形態(tài)觀察圖。
[0021] 圖2根據(jù)leSrDNA序列構(gòu)建的海洋桿菌G4及其相關(guān)種的系統(tǒng)發(fā)育樹示意圖。
[0022] 圖3瓊脂平板上因海洋桿菌G4的降解作用而形成的凹陷溶解圈或液化圈。
[0023] 圖4海洋桿菌G4胞外蛋白的SDS-PAGE電泳及Agarase activity staining酶譜分 析圖，圖中泳道1為Marker(分子量：14.4~97.4?。?，泳道2為菌株64胞外蛋白的505斗466電 泳結(jié)果，泳道3為瓊脂平板Agarase activity staining分析結(jié)果。
[0024]圖郎-瓊膠酶粗酶不同處理時間的寡糖產(chǎn)物化C分析圖，圖中泳道A、B、C分別為新 瓊二糖、新瓊四糖、新瓊六糖，泳道1、2、3分別為酶解6、12、24h后的寡糖產(chǎn)物。
[00巧]本發(fā)明提供的海洋桿菌菌株G4(Ma;rinobacter a化aerens)保藏于中國微生物菌 種保藏管理委員會普通微生物中屯、（CGMCC)，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國 科學院微生物研究所，郵編：100101，保藏編號：CGMCC No. 11016，保藏日期：2015年6月24 曰。
【具體實施方式】
[0026] 下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明技術(shù)方案做進一步說明。
[0027] 1.海洋桿菌菌株G4(Ma;rinobacter a