一種生產(chǎn)乙醇酸基聚合物的重組菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種生產(chǎn)己醇酸基聚合物的重組菌及其應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[000引 己醇酸（glycolic acid, hy化oxyacetic acid)別名居基己酸或α -居基己酸，是 最簡(jiǎn)單的居基駿酸。作為重要的化工產(chǎn)品和有機(jī)合成中間體，己醇酸在化工、醫(yī)藥、紡織、冶 金等多個(gè)領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用。例如，2%己醇酸和1%甲酸的混合酸是一種高效低成本的清洗 劑，可用于鍋爐、管道、冷凝器和熱交換器等的清洗；己醇酸分子小，能有效滲透毛孔，解決 皮膚老化、皺紋、暗瘡等問題，常用作化妝品添加劑；紡織行業(yè)中常用己醇酸作為染整羊毛 纖維及纖維素織品的交聯(lián)禪合劑；另外，己醇酸還可用作殺菌劑、粘接劑、石油破乳劑、焊接 劑W及化學(xué)助劑等。2011年，己醇酸市場(chǎng)為9330萬美元，預(yù)計(jì)未來幾年將W每年超過10% 的速度增長(zhǎng)，2018年己醇酸市場(chǎng)可能超過2億美元。
[0003] 己醇酸基聚合物（glycolate based polymers)是一種具有良好生物相容性和生 物可降解性的高分子材料，由己醇酸和其它居基駿酸單體聚合而成。己醇酸基聚合物可W 替代傳統(tǒng)的石油來源塑料用作普通包裝材料，也可W用于附加值較高的生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，比 如制備手術(shù)縫合線、藥物控釋載體、骨折固定材料、組織工程支架W及縫合補(bǔ)強(qiáng)材料等。乳 酸和己醇酸的共聚醋（poly lactate-co-glycolate)，簡(jiǎn)稱PLGA或PGLA，是研究較多的己 醇酸基聚合物，常用于制備微囊等控釋制劑，作為多種藥物、蛋白W及其它大分子的控釋載 體。PLGA已由美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（抑A)批準(zhǔn)用于醫(yī)療器械領(lǐng)域，目前已有多個(gè)產(chǎn)品 上市，例如世界衛(wèi)生組織（WHO)批準(zhǔn)的首個(gè)一次性注射疫苗微球、全球首個(gè)多膚控釋微球 注射劑等，日本、法國(guó)和我國(guó)等也先后批準(zhǔn)在醫(yī)藥領(lǐng)域使用PLGA。
[0004] 己醇酸基聚合物在工業(yè)上主要通過化學(xué)合成的方法制備。例如，W較純的己交醋 為前體，通過開環(huán)聚合可W獲得聚己醇酸；W己交醋和丙交醋為前體，通過開環(huán)聚合可W獲 得己醇酸乳酸共聚醋等?；瘜W(xué)聚合過程中往往需要重金屬離子作為催化劑，目前廣泛使用 的錫鹽類催化劑具有細(xì)胞毒性，出于人體安全性的考慮，限制了化學(xué)法合成的己醇酸基聚 合物在醫(yī)藥和食品等領(lǐng)域的應(yīng)用。2011年，Matsumoto等利用大腸桿菌脂肪酸氧化的強(qiáng)化 突變株LS5218首次實(shí)現(xiàn)了含有己醇酸單體的聚合物的生物合成。送也是目前為止利用微 生物發(fā)酵獲得己醇酸基聚合物的唯一報(bào)道。過表達(dá)來源于假單胞菌Pseudomonas SP. 61-3 的PHA聚合酶WiaClSTQK和來源于埃氏巨球型菌Megasphaera elsdenii的輔酶A轉(zhuǎn)移酶 化t，W十二酸和己醇酸為底物，細(xì)菌合成的聚合物中含有單體含量為17%的己醇酸組分， 其它居基脂肪酸單體3-居基了酸（3-皿）、3-居基己酸（3-HHx)、3-居基辛酸（3-H0)、3-居 基癸酸（3-皿）和3-居基十二酸（3-HDD)的含量分別為19%、22%、26%、8%和8%。由于 大腸桿菌對(duì)脂肪酸和己醇酸利用效果較差，導(dǎo)致細(xì)胞干重僅為0. 64g/l，聚合物含量也處于 較低水平，僅占細(xì)胞干重的4. 8%。由于生物量和聚合物含量都較低，導(dǎo)致聚合物的提取非 常困難，也無法對(duì)其材料學(xué)性能進(jìn)行研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種重組菌。
[0006] 本發(fā)明所提供的重組菌是將聚居基脂肪酸醋顆粒結(jié)合蛋白基因地aP、P皿生物合 成操縱子地bCAB、輔酶A轉(zhuǎn)移酶基因 pet、異巧樣酸裂解酶基因 aceA、異巧樣酸脫氨酶激酶 基因 aceK和己醒酸還原酶基因曲rA導(dǎo)入宿主大腸桿菌得到的。
[0007] 上述重組菌中，所述大腸桿菌為E. coli JM109或E. coli JM1091化A。
[0008] 上述重組菌中，所述E. coli JM1091化A是E. coli JM109缺失1化A基因后的菌。
[0009] 上述重組菌中，所述大腸桿菌E. coli JM1091化A的構(gòu)建方法包括如下步驟：
[0010] (1)制備如沈Q ID No. 3所示的DNA片段；
[0011] (2)將質(zhì)粒地D46 轉(zhuǎn)化至 E. coli JM109 中，得到 E. coli JM109(p邸46);
[0012] (3)誘導(dǎo)所述E. coli JM109(p邸46)菌株中的Red重組系統(tǒng)表達(dá)，再將所述DM片 段轉(zhuǎn)入所述E.coli JM109(pKD46)菌株中，經(jīng)過重組，得到1化A基因被Kan基因替換的重 組菌，記作 E. coli JM1091 化A-K(p邸46);
[0013] (4)去除所述E. coli JM1091化A-K(p邸46)菌株中的質(zhì)粒地D46,得到的重組菌記 作 E. coli JM1091 化A-K;
[0014] 妨將質(zhì)粒PCP20轉(zhuǎn)化至E. coli JM1091dM-K菌株中，去除Kan基因，得到的重組 菌記作 E. coli JM1091 化A。
[0015] 上述重組菌中，所述將聚居基脂肪酸醋顆粒結(jié)合蛋白基因地aP、P皿生物合成操 縱子地bCAB、輔酶A轉(zhuǎn)移酶基因 pet、異巧樣酸裂解酶基因 aceA、異巧樣酸脫氨酶激酶基因 aceK和己醒酸還原酶基因曲rA導(dǎo)入宿主大腸桿菌的方法具體是將表達(dá)盒1和表達(dá)盒2導(dǎo) 入宿主大腸桿菌。
[0016] 上述重組菌中，所述表達(dá)盒1是啟動(dòng)子序列、聚居基脂肪酸醋顆粒結(jié)合蛋白基因 地aP和P皿生物合成操縱子地bCAB依次連接得到的；
[0017] 所述表達(dá)盒2是啟動(dòng)子序列、輔酶A轉(zhuǎn)移酶基因 pet、己醒酸還原酶基因曲rA、異 巧樣酸裂解酶基因 aceA和異巧樣酸脫氨酶激酶基因 aceK依次連接得到的。
[0018] 上述重組菌中，所述表達(dá)盒是通過表達(dá)載體導(dǎo)入宿主菌的，所述表達(dá)盒1通過重 組表達(dá)載體P19-PCAB導(dǎo)入宿主菌，所述重組表達(dá)載體P19-PCAB是將所述表達(dá)盒1連入 PMD19-T的Pst I和EcoR I的酶切位點(diǎn)得到；所述表達(dá)盒2通過重組表達(dá)載體pMCS-pctAAK 導(dǎo)入宿主菌，所述重組表達(dá)載體pMCS-pctAAK是將所述表達(dá)盒2連入地BR1MCS-2的EcoR I 和化0 I的酶切位點(diǎn)得到。
[0019] 上述重組菌中，所述表達(dá)盒1的序列如SEQ ID No. 1所示；所述表達(dá)盒2的序列如 沈Q ID No. 2所示；
[0020] 所述聚居基脂肪酸醋顆粒結(jié)合蛋白基因地aP的序列如SEQ ID No. 1中第72-650 位核巧酸分子所示；
[0021] 所述P皿生物合成操縱子地bCAB的序列如SEQ ID No. 1中第682-4395位核巧酸 分子所示；
[0022] 所述輔酶A轉(zhuǎn)移酶基因 pet的序列如SEQ ID No. 2中第72-1625位核巧酸分子所 示；
[0023] 所述己醒酸還原酶基因曲rA的序列如SEQ ID No. 2中第1655-2593位核巧酸分 子所示；
[0024] 所述異巧樣酸裂解酶基因 aceA的序列如SEQ ID No. 2中第2623-3927位核巧酸 分子所示；
[00巧]所述異巧樣酸脫氨酶激酶基因 aceK的序列如SEQ ID No. 2中第4110-5826位核 巧酸分子所示；
[0026] 所述啟動(dòng)子序列如SEQ ID No. 1中第13-55位核巧酸分子所示或SEQ ID No. 2中 第13-55位核巧酸分子所示；
[0027] 所述1化A基因的序列如沈Q ID No. 4所示。
[0028] 上述所述的重組菌在生產(chǎn)己醇酸基聚合物中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0029] 本發(fā)明另一個(gè)目的是提供一種生產(chǎn)己醇酸基聚合物的方法。
[0030] 本發(fā)明提供的生產(chǎn)己醇酸基聚合物的方法包括如下步驟；W大腸桿菌可W利用的 單糖為底物，發(fā)酵培養(yǎng)上述所述的重組菌，得到己醇酸基聚合物。
[0031] 上述方法中，當(dāng)所述出發(fā)菌為E.coli JM109時(shí)，所述的己醇酸基聚合物是由己醇 酸、乳酸和3-居基了酸聚合得到的共聚物；當(dāng)所述出發(fā)菌為E. coli JM1091dM時(shí)，所述的 己醇酸基聚合物是由己醇酸和3-居基了酸聚合得到的共聚物。
[0032] 上述方法中，所述大腸桿菌可W利用的單糖具體為葡萄糖和/或甘露醇。
[0033] 上述方法中，所述發(fā)酵培養(yǎng)使用的培養(yǎng)基是MSG-Amp-Kan液體培養(yǎng)基和/或 LBG-Amp-Kan液體培養(yǎng)基和/或MSM-Amp-Kan液體培養(yǎng)基和/或LBM-Amp-Kan液體培養(yǎng)基。
[0034] 上述方法中，所述MSG