一種獲得安全、有效的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種獲得安全、有效的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell，MSC)是來源于發(fā)育早期中胚層和外胚層的一類多能干細(xì)胞。MSC具有免疫調(diào)節(jié)、促進(jìn)造血恢復(fù)、能夠修復(fù)損傷或病變的組織器官、具備多向分化潛能等功能，因此具有廣泛的應(yīng)用前景。
[0003]MSC最初在骨髓中被發(fā)現(xiàn)，目前我們已經(jīng)可以從脂肪、滑膜、骨骼、肌肉、肺、肝、胰腺等組織以及胎盤、羊水、臍帶中分離間充質(zhì)干細(xì)胞。從臍帶中分離間充質(zhì)干細(xì)胞具有采集方便、易于保存和運(yùn)輸、對(duì)供體無傷害、易分離、純度高、異體移植不會(huì)觸發(fā)免疫反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)。
[0004]目前從臍帶中分離間充質(zhì)干細(xì)胞的方法有組織塊貼壁法和酶消化法。酶消化法主要是采用膠原酶、胰蛋白酶、玻璃酸酶中的一種或者幾種對(duì)剪碎的組織塊進(jìn)行消化，其有一個(gè)致命缺點(diǎn)是損傷細(xì)胞，影響細(xì)胞的表征和功能。組織塊法雖然培養(yǎng)時(shí)間較長，但是其在細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞形態(tài)、免疫表型和分化潛能等方面均優(yōu)于酶消化法。
[0005]目前現(xiàn)行的最接近的技術(shù)方案:用含青霉素和鏈霉素的PBS緩沖液將健康的新生兒臍帶組織充分洗凈，去除血污;將臍帶剪成長度均勻的小段，進(jìn)行機(jī)械法分離，鈍性剝離華通膠，同時(shí)去除臍動(dòng)脈和臍靜脈;將剝離的華通膠均勻剪碎;用MSCs培養(yǎng)基重懸剪碎的華通膠，接種于明膠鋪被的培養(yǎng)皿中，置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細(xì)胞生長融合至80%_90%時(shí)進(jìn)行消化傳代。
[0006]目前技術(shù)缺陷:現(xiàn)有技術(shù)是采用普通的培養(yǎng)基來進(jìn)行臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)，培養(yǎng)周期較長;并且沒有提及相關(guān)檢測(cè)手段，無法保證獲得安全有效的細(xì)胞產(chǎn)品。
[0007]本發(fā)明既可以有效降低成本又可以快速獲得優(yōu)質(zhì)的間充質(zhì)干細(xì)胞，減少對(duì)細(xì)胞的傷害，縮短了培養(yǎng)周期，減少污染，而且能夠提高細(xì)胞純度。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明提供一種從人臍帶華通膠(Wharton’sJelly)中分離臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞并進(jìn)行傳代培養(yǎng)，最終獲得細(xì)胞產(chǎn)品的方法，要解決臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分離、培養(yǎng)過程中可能出現(xiàn)的分離效率低、周期長、安全性不足等問題。
[0009 ]本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是:
在臍帶獲得、臍帶運(yùn)輸、臍帶制備和細(xì)胞培養(yǎng)過程中采取檢測(cè)排查、添加抗生素等方法保證獲得無污染的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞從而保障安全性，在分離、培養(yǎng)過程中采用改良的培養(yǎng)體系和培養(yǎng)方法提高分離效率，縮短培養(yǎng)周期并能獲得高純度、表征優(yōu)良的細(xì)胞。
[0010]所述方法包括如下:
I)在無菌環(huán)境中，將臍帶消毒后放在添加了儲(chǔ)運(yùn)液的儲(chǔ)運(yùn)瓶中，送往實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分離制備；其中儲(chǔ)運(yùn)液為40ml的α-ΜΕΜ，并添加了慶大霉素100U/ml，青霉素50mg/ml，兩性霉素B5ug/ml;運(yùn)輸溫度為4-25°C，運(yùn)輸時(shí)間不超過24小時(shí)；
2)臍帶瓶用酒精擦拭后放入生物安全柜中；
3)在細(xì)胞培養(yǎng)皿中，使用洗滌液充分洗滌臍帶3-6次，將臍帶兩端各剪去Icm長度，丟棄;再洗滌臍帶組織2-4次;其中洗滌液為添加了 100U/ml慶大霉素，50mg/ml青霉素，5ug/ml兩性霉素B的醫(yī)用生理鹽水；
4)將臍帶剪成2cm長度的小段，清洗3次，轉(zhuǎn)移臍帶組織至新的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿中加生理鹽水至淹沒臍帶組織1/2處;去除靜脈血管和動(dòng)脈血管，撕取華通膠;華通膠置于加1ml洗滌液的50ml離心管中；
5)華通膠用洗滌液充分洗滌3次，再用生理鹽水洗滌2次，轉(zhuǎn)移至新的50ml離心管中，充分剪碎至Imm3?3mm3大??；
6)用去前段的1ml移液管將華通膠塊平分到4瓶已加25ml完全培養(yǎng)基的175cm2培養(yǎng)瓶中，輕輕搖晃使其均勻分布于瓶底;其中，完全培養(yǎng)基為α-ΜΕΜ中添加10% FBS及如下細(xì)胞因子組合:EGF 5?10ng/ml + PDGF 5?10ng/ml + TNF_a3?10 ng/ml + IFN-γ 3-10 ng/ml ；
7)小心將培養(yǎng)瓶放入37°C、5%C02培養(yǎng)箱中；培養(yǎng)最初7天，保持培養(yǎng)瓶絕對(duì)靜止；
8)第8天根據(jù)生長情況，用75%酒精消毒培養(yǎng)基瓶外壁，放置到生物安全柜內(nèi)；
9)用去頭移液管吸棄舊培養(yǎng)基，更換移液管，于非細(xì)胞培養(yǎng)面加入1ml生理鹽水，輕輕震蕩洗滌組織貼壁面，棄去，重復(fù)2次；
10)每瓶加消化液3ml，均勻浸潤細(xì)胞貼壁面，37°C孵育Imin或室溫孵育3min;待細(xì)胞變圓后每瓶加終止液10ml，快速震蕩，用1ml移液管吹打細(xì)胞貼壁面，吸出細(xì)胞懸液至2支50ml離心管中，各培養(yǎng)瓶每瓶加1ml生理鹽水，吹洗一次，匯入50ml離心管中；
11)1200rpm，離心6min，棄上清;合并沉淀至I管，加40ml生理鹽水再次離心洗滌，沉淀用1ml完全培養(yǎng)基重懸，經(jīng)細(xì)胞篩過濾，5ml完全培養(yǎng)基沖洗篩網(wǎng)，計(jì)數(shù)；
12 )根據(jù)細(xì)胞數(shù)量鋪瓶，使細(xì)胞濃度為3?5 X 104/ml，標(biāo)記，置37 °C、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
13)觀察細(xì)胞，細(xì)胞生長至接近愈合時(shí)進(jìn)行收獲凍存。
[0011 ]所述凍存的具體步驟為:
1)配置終止液，消化前3min將消化液放置到37°C水浴鍋中，把凍存母液平衡到4°C;
2)將細(xì)胞培養(yǎng)瓶取出，用75%酒精消毒瓶底，放入生物安全柜內(nèi)；
3)用移液管吸棄舊培養(yǎng)基，更換移液管，于非細(xì)胞培養(yǎng)面加入1ml生理鹽水，輕輕搖晃使其覆蓋整個(gè)瓶底，吸棄細(xì)胞洗滌液，重復(fù)洗滌一次；
4)每瓶加入3ml消化液，37°C消化Imin，當(dāng)細(xì)胞明顯回縮后，加入終止液1ml/瓶，終止消化，收集所有液體到50ml離心管中，再每瓶加1ml生理鹽水，輕柔吹打后匯入50ml離心管中；
5)1200轉(zhuǎn)/min離心6min，棄上清，細(xì)胞沉淀用16ml生理鹽水懸浮，混勾取Iml做計(jì)數(shù)和流式檢測(cè)；
6)加生理鹽水至40ml，取500μ1上清做內(nèi)毒素檢測(cè)，1200rpm，離心6min；
7)將上清倒入潔凈的離心管中，做菌檢和支原體檢測(cè)，離心沉淀用2.5mlFBS懸浮，再緩慢加入2.5ml凍存母液，混勻后分裝到凍存管中，每管Iml;凍存細(xì)胞數(shù)為5-10 X 106/ml，如果細(xì)胞太少應(yīng)增加傳代；
8)標(biāo)記細(xì)胞代數(shù)、密度、條形碼和操作時(shí)間于管壁外；
9)將凍存管置于預(yù)先4°C處理的程序降溫盒中，放置-80°C對(duì)開門冰箱中24h，再將樣本轉(zhuǎn)入液氮罐中，記錄儲(chǔ)存位置。
[0012]優(yōu)選的所述的細(xì)胞因子組合:EGF6ng/ml + PDGF7ng/ml + TNF_a5ng/ml + IFN-γ 5ng/ml。
[0013]所述的消化液含0.25wt.% 胰酶、0.03wt.%EDTA。
[0014]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:
在臍帶獲得、臍帶運(yùn)輸、臍帶制備和細(xì)胞培養(yǎng)過程中采取檢測(cè)排查、添加抗生素等方法保證獲得無污染的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞從而保障安全性，在分離、培養(yǎng)過程中采用改良的培養(yǎng)體系和培養(yǎng)方法提高分離效率，縮短培養(yǎng)周期并能獲得高純度、表征優(yōu)良的細(xì)胞。
[0015]在培養(yǎng)基中加入EGF、PDGF、TNF_a和IFN-γ同時(shí)加入培養(yǎng)體系中可以有效促進(jìn)MSC的增殖，從而有效縮短培養(yǎng)時(shí)間，并能維持其表型特征。
[0016]靜止培養(yǎng)7天，有助于促進(jìn)組織塊的貼壁和細(xì)胞的爬出。儲(chǔ)運(yùn)液和洗滌液中添加了慶大霉素，青霉素，兩性霉素B能夠有效預(yù)防和控制細(xì)菌、真菌污染。細(xì)胞收獲時(shí)進(jìn)行計(jì)數(shù)、流式檢測(cè)、內(nèi)毒素檢測(cè)、支原體檢測(cè)、細(xì)菌培養(yǎng)檢測(cè)等，只有各項(xiàng)檢測(cè)均合格才準(zhǔn)予入庫儲(chǔ)存，從細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞表征和有無微生物污染等多方面保證了細(xì)胞產(chǎn)品的有效性和安全性。
【附圖說明】
[0017]圖1.實(shí)施例1臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在分離、培養(yǎng)過程中的狀態(tài)(40倍顯微鏡下觀察)。a)組織塊鋪瓶7天之后的細(xì)胞狀態(tài);b)組織塊鋪瓶12天之后的細(xì)胞狀態(tài);c) PO傳Pl第2天的細(xì)胞狀態(tài);d) PO傳Pl第4天的細(xì)胞狀態(tài);e) PO傳Pl第6天的細(xì)胞狀態(tài)。
[0018]圖2.實(shí)施例1臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞流式檢測(cè)結(jié)果圖。
[0019]圖3.實(shí)施例2臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在PO傳Pl第4天的細(xì)胞狀態(tài)。
[0020]圖4.實(shí)施例3臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在PO傳Pl第4天的細(xì)胞狀態(tài)。
[0021]圖5.市售培養(yǎng)基培養(yǎng)的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在PO傳Pl第4天的細(xì)胞狀態(tài)。
[0022]圖6.不同培養(yǎng)基配方的培養(yǎng)時(shí)間統(tǒng)計(jì)。
【具體實(shí)施方式】
[0023]實(shí)施例1
I臍帶制備:
I)在無菌環(huán)境中，第三產(chǎn)程時(shí)采集臍帶，注意放盡臍帶動(dòng)靜脈殘血并結(jié)扎;采集后的臍帶消毒后放在添加了儲(chǔ)運(yùn)液的儲(chǔ)運(yùn)瓶中，送往實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分離制備。其中儲(chǔ)運(yùn)液為40ml的α-ΜΕΜ，并添加了慶大霉素100U/ml，青霉素50mg/ml，兩性霉素B 5ug/ml。采集前確保孕婦病毒五項(xiàng)檢測(cè)均為陰性、ALT檢測(cè)合格。運(yùn)輸溫度為4°C，運(yùn)輸時(shí)間不超過24小時(shí)。
[0024]2)臍帶瓶用酒精擦拭后放入生物安全柜中。
[0025]3)在150cm2細(xì)胞培養(yǎng)皿中，使用洗滌液充分洗滌臍帶3次，用尖頭直剪將臍帶兩端各剪去I cm長度，丟棄。再洗滌臍帶組織2次。其中洗滌液為添加了 100U/ml慶大霉素，50mg/ml青霉素，5ug/ml兩性霉素B的醫(yī)用生理鹽水。
[0026]4)用尖頭直剪將臍帶剪成約2cm長度的小段，清洗3次。轉(zhuǎn)移臍帶組織至一新的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿中加生理鹽水至淹沒臍帶組織1/2處。去除靜脈血管