一種人可溶性icosl elisa試劑盒及其檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于免疫分析技術(shù)領(lǐng)域，設(shè)及一種定量檢測(cè)人可溶性IC0SL的化ISA試劑 盒，利用該試劑盒進(jìn)行定量檢測(cè)的方法。
[0002]
【背景技術(shù)】
[0003] 目前已知的許多受體-配體相互作用都參與誘導(dǎo)、建立和調(diào)節(jié)抗原特異性免疫反 應(yīng)，其中T細(xì)胞的活化需要雙信號(hào)，抗原膚-MHC分子復(fù)合物與T細(xì)胞受體(TCR)的結(jié)合提供了 第一信號(hào)，而第二信號(hào)則來源于抗原呈遞細(xì)胞（APC)和T細(xì)胞表面共刺激分子 (costimulato巧molecule)的相互作用，缺乏第二信號(hào)將導(dǎo)致T細(xì)胞失能或程序性死亡。由 此可見，共刺激信號(hào)是T細(xì)胞克隆擴(kuò)增、分化和發(fā)揮生物效應(yīng)所必不可少的。
[0004] 近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)被廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)研究，共刺激分子被不斷發(fā)現(xiàn)。 運(yùn)些共刺激分子按其結(jié)構(gòu)的不同可分為兩類：一類是腫瘤壞死因子/腫瘤壞死因子受體 (TNF/TNFR)超家族，包括 CD40/CD40L、CD27/CD27L、CD30/CD30L、4-lBB/4-lBBL、0X40/ 0X40L、RANK/RANKL和化s/化sL等；另一類是免疫球蛋白（Ig)超家族，包括CD28/CTLA4-B7、 1^\尸1-1〔41-1/^41-2/1〔41-3、1〇)5-1〇)51^、〔02-口^4-3等。運(yùn)些共刺激分子^受體和配體相 互作用的方式傳導(dǎo)信號(hào)。受體和配體一般表達(dá)在不同的細(xì)胞表面，通常一個(gè)為持續(xù)性表達(dá)， 一個(gè)是誘導(dǎo)性表達(dá)。在免疫應(yīng)答的不同階段，運(yùn)些分子W各自獨(dú)特而又相關(guān)聯(lián)的方式參與 信號(hào)傳導(dǎo)，共同調(diào)控機(jī)體的免疫應(yīng)答。
[000引可誘導(dǎo)共刺激分子（inducible costimulator，IC0S)是1999年由Hutloff等人發(fā) 現(xiàn)的CD28家族的新成員，IC0S是由兩個(gè)亞單位構(gòu)成的同源二聚體I型跨膜蛋白，屬于免疫球 蛋白超家族。IC0S的胞漿區(qū)含有YMFM基序，能與PI3K激酶結(jié)合，胞外區(qū)含有一個(gè)V樣Ig功能 區(qū)，其中的抑PPF基序是與相應(yīng)配體ICO化結(jié)合的結(jié)構(gòu)，IC0S主要表達(dá)于濾泡輔助性T細(xì)胞(T follicular helper，Tfh)、活化T細(xì)胞和效應(yīng)/記憶性T細(xì)胞上。IC0S的配體IC0SU又稱為 hB7RP-l，B7-H2，hLIC0S)是由309個(gè)氨基酸組成的I型跨膜糖蛋白，約63~72 kDa，胞外區(qū)包 含IgV、IgC區(qū)，胞內(nèi)段則根據(jù)不同的生理環(huán)境及細(xì)胞自身的狀態(tài)而剪接形成不同的異構(gòu)體， 其中的4個(gè)半脫氨酸及igV區(qū)80位的酪氨酸都是保守位點(diǎn)，不僅是B7家族的標(biāo)志性位點(diǎn)，而 且對(duì)于免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)的形成也十分重要。ICO化主要表達(dá)在B細(xì)胞(例如淋己結(jié)的皮質(zhì) 區(qū)和淋己濾泡、脾的邊緣帶，此外在扁桃體B細(xì)胞的表面也有低水平表達(dá)）、單核細(xì)胞、部分 樹突狀細(xì)胞和巨隧細(xì)胞上，提示ICO化在B細(xì)胞參與的體液免疫應(yīng)答中可能發(fā)揮著重要作 用。除在淋己組織表達(dá)W外，ICO化在腎、屯、、膀脫和腦等非淋己組織也有表達(dá)，表明該分子 可能具有多方面的功能。多種因素可調(diào)控ICO化的表達(dá)，外周血中未經(jīng)刺激的B細(xì)胞、單核細(xì) 胞表面低水平表達(dá)ICO化，經(jīng)IFN-丫、TNF-a、LPS刺激后，ICO化的表達(dá)迅速上調(diào)。
[0006] IC0S的生物學(xué)功能與經(jīng)典共刺激分子CD28不盡相同。CD28是誘導(dǎo)初始T細(xì)胞增殖 活化的關(guān)鍵性分子，而IC0S則是活化后促進(jìn)T細(xì)胞分化并發(fā)揮效應(yīng)的主要共刺激分子。CD28 主要參與機(jī)體的初次免疫應(yīng)答，而IC0S主要是在再次免疫應(yīng)答W及免疫記憶中發(fā)揮重要作 用，對(duì)維持Τ細(xì)胞效應(yīng)和記憶細(xì)胞活化、免疫球蛋白類型轉(zhuǎn)換、調(diào)節(jié)化1/化2細(xì)胞極化等有重 要作用。另外，ICOS在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中所扮演的重要角色之一就是維持Tfh的產(chǎn)生，因此無論對(duì) 于人類還是小鼠而言，ICOS缺陷都會(huì)導(dǎo)致T扣生成缺陷，影響生發(fā)中屯、（germinal center, GC)反應(yīng)，并使抗體產(chǎn)生減少。此外，已有研究證明，抗原呈遞細(xì)胞上的ICO化對(duì)于Τ扣細(xì)胞分 化和維持都有重要作用。清華大學(xué)祁海教授新近在化化re等雜志上發(fā)表文章指出，IC0S可 W在獨(dú)立于共刺激信號(hào)之外，通過促進(jìn)T細(xì)胞的隨機(jī)運(yùn)動(dòng)能力來直接控制T細(xì)胞向淋己器官 濾泡區(qū)遷移，進(jìn)而決定T細(xì)胞的分化方向，但旁觀者B細(xì)胞表達(dá)ICO化是其必要條件。當(dāng)旁觀 者B細(xì)胞無法表達(dá)ICO化時(shí)，活化的輔助T細(xì)胞無法正常發(fā)育為Tfh，也不能引起最佳的GC反 應(yīng)，運(yùn)說明旁觀者B細(xì)胞在促進(jìn)T扣發(fā)育中起著至關(guān)重要的作用。
[0007] IC0S/IC0化信號(hào)通路的異常與多種自身免疫性疾?。ㄈ珙愶L(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性 紅斑狼瘡、多發(fā)性硬化等)的發(fā)病密切相關(guān)。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是一種由多種因素導(dǎo)致的自身 免疫性疾病，在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者及小鼠動(dòng)物模型中均發(fā)現(xiàn)多種免疫學(xué)功能的異常，其 中最突出的就是產(chǎn)生致病性的自身抗體、T細(xì)胞/B細(xì)胞免疫功能的缺陷、自身抗體及免疫復(fù) 合物清除障礙等。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者體內(nèi)T細(xì)胞/B細(xì)胞相互作用時(shí)通過共刺激分子產(chǎn)生 的抗調(diào)亡信號(hào)促使自身反應(yīng)性B細(xì)胞大量增殖，并產(chǎn)生高滴度的自身抗體，而運(yùn)些自身抗體 的某些亞型及其免疫復(fù)合物介導(dǎo)了疾病的組織損傷。在多個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中，采用抗體阻斷 IC0S與其配體的相互作用，可W減少促炎癥因子的產(chǎn)生及抗體的形成，并且顯著減弱關(guān)節(jié) 炎的嚴(yán)重程度，還可W減少CIA模型小鼠的引流淋己結(jié)和脾的濾泡輔助T細(xì)胞和生發(fā)中屯、B 細(xì)胞的數(shù)量。由此可見，IC0S途徑在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的免疫病理過程中發(fā)揮復(fù)雜而重要的 作用。
[0008] 大量研究表明，許多共刺激分子W細(xì)胞膜型和可溶性兩種形式存在。其中，可溶性 分子大多通過膜型分子而形成，但也有某些可溶性分子由專一的缺失跨膜區(qū)的基因編碼 (例如CTLA-4)。機(jī)體中可溶性分子和膜表面的分子一樣具有相應(yīng)的生物學(xué)功能:一方面，細(xì) 胞膜上的分子能夠通過直接的受體/配體相互作用來介導(dǎo)共刺激信號(hào)；另一方面，可溶性蛋 白因子能夠像細(xì)胞因子一樣參與血液循環(huán)，并且在免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，其既 能夠影響鄰近細(xì)胞，又能夠和遠(yuǎn)端細(xì)胞表面的受體相互結(jié)合，從而參與疾病的發(fā)生、發(fā)展， 其發(fā)揮作用的廣度和深度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過細(xì)胞膜表面的分子。迄今為止，因缺乏有效的檢測(cè)方法， 國(guó)內(nèi)外尚未有對(duì)可溶性ICO化(sICO化)的研究報(bào)道。
[0009]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 要解決的技術(shù)問題:針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明提供了一種基于改 良雙抗體夾屯屯LISA方法研制的人可溶性IC0SL ELISA試劑盒，并利用該試劑盒成功完成了 人sICO化的定量檢測(cè)。
[00川技術(shù)方案： 一對(duì)用于制備抗人可溶性IC0SL單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株： 雜交瘤細(xì)胞株2B4,其已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中屯、 (CGMCC)，保藏編號(hào)為CGMCC NO: 11291，保藏日為2015年10月21日，保藏地址為北京市朝陽(yáng) 區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所； 雜交瘤細(xì)胞株20B10,其已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中屯、 (CGMCC)，保藏編號(hào)為CGMCC Ν0:11187,保藏日為2015年8月10日，保藏地址為北京市朝陽(yáng)區(qū) 北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所。
[0012] 上述一對(duì)雜交瘤細(xì)胞株在制備人可溶性IC0SL ELISA試劑盒中的用途，其中雜交 瘤細(xì)胞株2B4用于產(chǎn)生檢測(cè)抗體，雜交瘤細(xì)胞株20B10用于產(chǎn)生包被抗體。
[0013] 一對(duì)抗人可溶性ICO化單克隆抗體： 單克隆抗體2B4，其由上述雜交瘤細(xì)胞株2B4產(chǎn)生，其包括輕鏈和重鏈，其氨基酸序列分 別如序列表中SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO:2所示，其編碼基因的核巧酸序列分別如序列表中 沈Q ID NO:3和沈Q ID NO:4所示； 單克隆抗體20B10,其由上述雜交瘤細(xì)胞株20B10產(chǎn)生，其包括輕鏈和重鏈，其氨基酸序 列分別如序列表中SEQ ID N0:5和SEQ ID N0:6所示，其編碼基因的核巧酸序列分別如序列 表中沈Q ID NO:7和沈Q ID NO:8所示。
[0014] 上述一對(duì)抗人可溶性ICO化單克隆抗體在制備人可溶性ICOSL ELISA試劑盒中的 用途，其中單克隆抗體2B4用作檢測(cè)抗體，單克隆抗體20B10用作包被抗體。
[0015] -種人可溶性ICO化ELISA試劑盒，其包括如下組分： (1) 固相載體:酶標(biāo)板，1塊； (2) 包被抗體:抗人ICO化單克隆抗體20B10，30yg/管，1管； (3) 檢測(cè)抗體:抗人ICO化單克隆抗體2B4，lOyg/管，1管； (4) 抗體稀釋液:0.01M碳酸鹽緩沖液(CBS)，pH9.6，50mL/瓶，1瓶； 巧)封閉液:牛血清白蛋白（BSA)溶液，2g/100mL，30mL/瓶，1瓶； (6) 樣品稀釋液:0.01M憐酸鹽緩沖液(PBS)，含有0.5%牛血清白蛋白，250mL/瓶，1瓶； (7) 標(biāo)準(zhǔn)品蛋白：ICO化-Ig融合蛋白，25ng/管，1管； (8) 酶標(biāo)二抗:鏈霉親和素-辣根過氧化物酶偶聯(lián)物(S化eptavidin-HRP，1: 3000)，10μ g/管，1管； (9) 底物:3,3'，5,5'-四甲基聯(lián)苯胺(了18)，10血/管，1管； (10) 洗液:0.01M憐酸鹽緩沖液，含有0.2%吐溫20，lOOmL/瓶，1瓶;和 (11) 終止液:2M硫酸，5血/管，1管。
[0016] 上述人可溶性IC0SL ELISA試劑盒在定量檢測(cè)人體血清、血漿或組織液內(nèi)sICO化 中的用途，并具體公開了一種利用上述ELISA試劑盒進(jìn)行人sICO化定量檢測(cè)的方法，其包括 如下步驟： (1) 采用抗體稀釋液將包被抗體配制成濃度為化g/mL的包被抗體工作液，然后按照100 μL孔的用量加入到酶標(biāo)板中，于4°C靜置，過夜； (2) 棄掉酶標(biāo)板