一種尖吻蝮蛇凝血酶及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種尖吻峻蛇凝血酶的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 蛇毒是毒蛇毒腺分泌的一種成分復(fù)雜的液體，含有多種蛋白質(zhì)、多膚、酶類和其它 小分子物質(zhì)，具有廣泛的生物活性，目前研究人員已從幢科桐峻蛇屬峻蛇 (Bot虹opsatrox)、長白山白眉峻蛇等蛇毒中發(fā)現(xiàn)多種類凝血酶。
[0003] 尖吻峻蛇(Agkis化odonacutus)，幢科尖吻峻屬，廣泛分布于中國華南地區(qū)。尖吻 峻蛇凝血酶化aemocoagulaseAcu化S，簡寫為化lase)是從尖吻峻蛇蛇毒中分離純化的一種 類凝血酶。它通過水解纖維蛋白的Αα鏈，使纖維蛋白原降解為纖維蛋白單體。專利 CN1218747公開了尖吻峻蛇凝血酶化lase用作治療出血性疾病藥物的用途，藥理和毒理研 究表明其具有較強的止血作用和極低的毒性。
[0004] 專利CN100523185公開了一種尖吻峻蛇蛇毒類凝血酶的制備方法，通過透析、兩步 DEAE-SepharoseFF層析梯度洗脫和SephadexG25層析分離得到蛇毒類凝血酶，其純度為 95%。
[0005] 專利CN101812436公開了一種單膚鏈的尖吻峻蛇蛇毒類凝血酶及其制備方法，得 率為0.028%。其工藝包含^次0646-5日9}1日'〇3日。。層析，其中前兩次使用酸性的低濃度 NaCl-PBS溶液進行梯度洗脫，第Ξ次層析使用堿性的低濃度NaCl-PBS溶液進行梯度洗脫。
[0006] 專利CN101 5605 10公開了 一種尖吻峻蛇蛇毒類凝血酶，通過在兩次DEAE- SepharoseFF中使用堿性化C1-PBS溶液進行梯度洗脫，再采用透析或Se地adex-G25脫鹽制 備得純度不低于95%的產(chǎn)品，得率為0.7%-0.8%。
[0007] 專利CN102757948公開了一種低流速下通過兩次Se地adex-G75層析和一次DEAE- S巧haroseFF層析制備出純度為97.5%的尖吻峻蛇蛇毒類凝血酶的方法。
[000引專利CN103160485公開了 一種尖吻峻蛇凝血酶-C，通過硫酸錠分級沉淀、兩次 DEAE-SepharoseFF層析，最后W透析或S邱]iadex-G25脫鹽得到比活力不低于40U/mg、純度 不低于95 %的尖吻峻蛇蛇毒類凝血酶。
[0009] 現(xiàn)有的從尖吻峻蛇蛇毒中提取純化尖吻峻蛇蛇毒類凝血酶的方法大多設(shè)及長時 間的透析且需多次換液，另外陰離子交換層析步驟往往要求線性洗脫或多步洗脫，存在方 法復(fù)雜、效率不高等問題。
[0010] 因此，有必要尋找一種簡單高效、可應(yīng)用于大規(guī)模生產(chǎn)的分離純化工藝，制備出高 活性的尖吻峻蛇凝血酶。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明目的在于提供一種尖吻峻蛇凝血酶及其制備方法。該方法適合大規(guī)模生 產(chǎn)、操作簡單、效率高;制備的尖吻峻蛇凝血酶產(chǎn)品產(chǎn)率高，純度高達99% W上，比活力不低 于180U/mg。
[0012] 本發(fā)明提供的技術(shù)方法通過W下步驟實現(xiàn)：
[0013] (1)粗品澄清：W0.01M憐酸鹽緩沖液溶液(pH值為6.2~6.9)溶解尖吻峻蛇蛇毒粗 品制成蛇毒溶液，蛇毒溶液經(jīng)孔徑0.45WI1的微濾膜過濾，收集濾液；
[0014] (2)超濾除雜:將步驟(1)所得濾液經(jīng)孔徑10NMWC超濾膜過濾，收集濾液；
[001引 （3)將步驟（2)所得濾液進行DEAE-SepharoseFast Flow第一次層析，用含 0.05M化C1的0.01M憐酸鹽緩沖液（pH值為6.2~6.9)洗脫，收集有效峰組分，W孔徑為 10NMWC超濾膜超濾濃縮，收集濾液；
[0016] (4)將步驟（3)所得濾液進行DEAE-Sepharose化St Flow第二次層析，用含0.03M 化C1和0.1M化C1的0.01M憐酸鹽緩沖液(pH值為7.2~7.9)-憐酸鹽緩沖液依次洗脫，收集 有效峰組分，W孔徑10NMWC超濾膜超濾濃縮，收集濾液；
[0017] (5)除熱原：將步驟(4)所得濾液使用Superdex-75pg層析柱，用0.01M憐酸鹽緩沖 液溶液(pH值為7.2~7.9)洗脫，收集有效峰組分；
[0018] (6)脫鹽:將步驟(5)所得濾液使用Sepadex-G25層析柱，用注射用水洗脫，對已除 熱原的上述組分進行脫鹽，收集有效峰組分，得到尖吻峻蛇凝血酶。
[0019] 將所得的尖吻峻蛇凝血酶加賦形劑過濾、分裝和冷凍干燥，可制作成注射用尖吻 峻蛇凝血酶。
[0020] 步驟(1)是對尖吻峻蛇蛇毒的預(yù)處理，W微濾替代傳統(tǒng)的離屯、取上清液，可有效去 除懸浮物、部分細菌、大分子膠體等物質(zhì)，獲得適合進一步分離的澄清蛇毒溶液，操作簡便、 效率高。
[0021] 步驟(2)通過超濾截留分子量大于lOkDa的物質(zhì)，可除去蛇毒溶液中大部分小分子 雜質(zhì)。應(yīng)用超濾技術(shù)，操作簡單，截留效果好，能夠極大地提高下一步陰離子交換層析的分 離效率。而傳統(tǒng)的透析方法不僅耗時長，且若透析期間換液不當(dāng)會嚴重影響透析效果。
[0022] 步驟(3)使用偏酸性的憐酸鹽緩沖液沖洗，再用含低濃度化C1的憐酸鹽緩沖液進 行目標(biāo)物的洗脫。
[0023] 步驟(4)使用偏堿性的憐酸鹽緩沖液沖洗，再分別兩個不同濃度的化α-憐酸鹽緩 沖液進行目標(biāo)物的洗脫。步驟(4)可分離得尖吻峻蛇凝血酶，純度可達到95% W上。操作簡 單，純化效率高。
[0024] 步驟(5)中的Superdex-75pg層析柱分辨率高，可進一步純化尖吻峻蛇凝血酶并去 除熱原。步驟(6)采用S邱adex-G25層析柱進行脫鹽。由于脫鹽后的蛋白質(zhì)容易變性，在對尖 吻峻蛇凝血酶去除熱原后再進行脫鹽可最大限度地保留酶活力。脫鹽后的尖吻峻蛇凝血酶 宜馬上冷凍干燥，或加入賦形劑制成凍干粉注射劑等劑型。
[0025] 本發(fā)明分離純化的尖吻峻蛇凝血酶的HPLC分析純度高達99^上％，比活力不低于 180U/mg，SDS-PGE電泳呈現(xiàn)兩條帶。
[0026] 本發(fā)明的優(yōu)勢在于，通過微濾與超濾可替代長耗時且操作相對復(fù)雜的離屯、與透 析，在有效縮短分離純化工藝時間，同時較好地保護了尖吻峻蛇凝血酶的活性。兩步陰離子 柱層析的洗脫步驟簡單明確，可控性強;結(jié)合超濾技術(shù)，大大提高了尖吻峻蛇凝血酶分離純 化的效率，得率遠高于現(xiàn)有技術(shù)，適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。
【附圖說明】
[0027] 圖巧本發(fā)明實施例1制得的尖吻峻蛇凝血酶HPLC圖譜。
[0028] 圖2為本發(fā)明實施例1制得的尖吻峻蛇凝血酶的SDS-PAGE電泳圖。
【具體實施方式】
[0029] 下面結(jié)合具體的實施例對本發(fā)明做進一步的詳細說明，但本發(fā)明并不局限于此。 根據(jù)本發(fā)明精神對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改均屬于本發(fā)明的范圍。
[0030] 實施例1
[0031] 取尖吻峻蛇蛇毒粉末7.5g，至于4°C層析柜中用0.01M憐酸鹽緩沖液溶液(pH 6.8) 攬拌溶解，待蛇毒完全溶解后，用憐酸鹽緩沖液稀釋，使用如ixStandand Benchtop System (GE Healthcare公司）進行微濾（微濾柱型號：CFP-4-E-4MA，0.45皿，GE Healthcare)，收集 濾液并加入憐酸鹽緩沖液稀釋。使用QuixStandand Benchtop System對上述濾液稀釋液進 行超濾（超濾柱型號：UFP-10-E-4MA，10NMWC，GE Healthcare),樣品溶液用于進一步的層 析。層析柱皆連接于AKTA prime plus蛋白分離純化儀(GE Healthcare)。
[0032] 用0.01M憐酸鹽緩沖液溶液（pH6.8)先平衡DEAE-SepharoseFastFlow層析柱 (GE化althcare)，然后對上述樣品溶液進行上樣（lOml/min)。上樣完畢后，即用0.01M憐酸 鹽緩沖液溶液(pH 6.8)沖洗(35ml/min)至紫外檢測器無峰信號檢出，再用含0.05MNaCl的 0.01M憐酸鹽緩沖液(pH 6.8)洗脫目標(biāo)物（1〇1111/111山），收集出峰組分，超濾濃縮。用冊1(：、 SDS-PAGE電泳和促人血漿凝固活性檢測方法監(jiān)測其是否為目標(biāo)組分，結(jié)果與目標(biāo)產(chǎn)一致。
[0033] 用0.01M憐酸鹽緩沖液溶液(pH7.5)先平衡DEAE-Sepharose化stFlow層析柱(GE 化althcare)，然后對上述濾液進行上樣（lOml/min)。上樣完畢后，即用0.01M憐酸鹽緩沖液 溶液(pH 7.5)沖洗(35ml/min)至紫外檢測器無峰信號檢出，再分別用含0.03M化α和0.1M 化C1的0.01Μ憐酸鹽緩沖液(pH 7.5)洗脫目標(biāo)物(2〇1111/111^)，收集出峰組分，并超濾濃縮， 收集濾液。用HPLC、SDS-PAGE電泳和促人血漿凝固活性檢測方法監(jiān)測其是否為目標(biāo)組分。
[0034] 用0.01M憐酸鹽緩沖液溶液（pH 7.5)先平衡S叫erdeχ-75pg層析柱（GE 化althcare)，然后對上述含有目標(biāo)組分的濾液進行上樣(20ml/min)。上樣完畢后，用0.01M 憐酸鹽緩沖液溶液(pH 7.5)洗脫目標(biāo)物(20ml/min)，收集最大出峰組分。用HPLC、SDS-PAGE 電泳和促人血漿凝固活性檢測方法監(jiān)測其是否為目標(biāo)組分。
[0(X3日]用注射用水先平衡Se地adex-G25層析柱(GE化althcare)，然后對上述溶液進行 上樣(20ml/min)，上樣完畢后，用注射用水洗脫目標(biāo)物(20ml/min)，收集出峰組分。經(jīng)測定， 分離純化所得的尖吻峻蛇凝血酶HPLC分析純度高達99.69 %，得率為:8.43 %。結(jié)果見表1、 表2。尖吻峻蛇凝血酶比活力不低于180U/mg，SDS-PGE電泳呈現(xiàn)兩條帶。
[0036] 表1尖吻峻蛇凝血酶的HPLC譜圖相對峰面積
[0037]
[0038] 表2尖吻峻蛇凝血酶的分離純化結(jié)果
[0039]
[0041 ] 實施例2
[0042] 取尖吻峻蛇蛇毒粉末30g，至于4°C層析柜中用0.0 IM憐酸鹽緩沖液溶液(pH 6.5) 攬拌溶解，待蛇毒完全溶解后，用憐酸鹽緩沖液稀釋，使用如ixStandand Benchtop System (GE Healthcare公司）進行微濾（微濾柱型號：CFP-4-E-4MA，0.45皿，GE Healthcare)，收集 濾液并加入憐酸鹽緩沖液稀釋。使用QuixStandand Benchtop System對上述濾液稀釋液進 行超濾（超濾柱型號：UFP-10-E-4MA，10NMWC，GE Healthcare),樣品溶液用于進一步的層 析。層析柱皆連接于AKTA prime plus蛋白分離純化儀(GE Healthcare)。
[0043] 用0.01M憐酸鹽緩沖液溶液（pH6.2)先平衡DEAE-SepharoseFastFlow層析柱 (GE化althcare)，然后對上述樣品溶液進行上樣