蛋白等電點(diǎn)W及分子量的相關(guān)分 析。該基因編碼蛋白含671個(gè)氨基酸，分子量為74KD，等電點(diǎn)為7.85。
[0039] (二)棉花L服2的誘導(dǎo)表達(dá)分析
[0040] 所用棉花為3個(gè)星期苗齡，病原菌培養(yǎng)條件為:菌株為落葉型強(qiáng)致病力病原菌V991 (徐榮旗，汪佳妮，陳捷胤等.棉花黃萎病菌T-DNA插入突變體表型特征和側(cè)翼序列分析.中 國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010,43(3) :489-496;張?zhí)煺?，周兆華，巧留芳，等.棉花對(duì)黃萎病的抗性遺傳 模式及抗(耐）病品種的選育技術(shù).作物學(xué)報(bào)，2000,26(6):673-680)和非落葉型菌株BP2 (Baolong Zhang,Yuwen Yang,Tianzi Chen et al. Island Cotton GbvelGene Encoding A Receptor-Like Protein Confers Resistance to Both Defoliating and Non- Defoliating Isolates of Ve;rticillium d址liae,PloS ONE,7(12) :e51091)。病原菌經(jīng) PDA平板活化后，從菌落邊緣挑取菌塊放入PDB培養(yǎng)液（馬鈴馨200g，沸水煮40分鐘，雙層紗 布過濾，加入20g葡萄糖，定容至1L，121°C高溫高壓滅菌20min)，25°C，120r · min培養(yǎng)5-6d， 用紗布過濾培養(yǎng)液，鏡檢并用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。接種方法為薩根法(Fradin F.，Abd-E 1 - Haliem A. ,Masini L.et al, Interfamily Transfer of Tomato VeIMediates Verticillium Resistance in Arabidopsis,Plant Physiology,2011,156:2255-226)，將 分生抱子濃度調(diào)整為IX lO^mL，將棉花根系洗凈在分生抱子野種浸泡5min后，栽入±中。 分別采集未誘導(dǎo)和誘導(dǎo)后棉花根系，提取總RNA并合成cDNA，并進(jìn)行后續(xù)的RT-PCR分析(RNA 提取方法及cDNA合成方法見附錄），引物序列為：
[0041 ] P5:5 '-ATTGGGAACTTTGGTATGGCAAG-3 '
[0042] P6:5 '-CATAAGCAAATATGTCAATGCCTG-3 '。
[0043] 表達(dá)分析結(jié)果顯示V991和BP2處理2d后，根系中L服2基因表達(dá)量明顯增加，上調(diào)表 達(dá)，V991處理在8天達(dá)到最高，而BP2處理在12天達(dá)到最高（圖1)。
[0044] (四）LRK1基因植物表達(dá)載體的構(gòu)建W及植物轉(zhuǎn)化
[0045] W上述已經(jīng)構(gòu)建好的pGEM-T easy:L服2質(zhì)粒為模板，用Xbal/BamHI酶切，并回收 201669片段，與9〔曰11161曰2301載體連接，經(jīng)測序驗(yàn)證100%匹配，獲得的陽性質(zhì)粒命名為 pCambia2301:L服2。提取質(zhì)粒后，用凍融法將重組載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404(上海北諾 生物科技有限公司）。用薩花法轉(zhuǎn)化擬南芥，在1/2MS卡那抗性(2化g/mL)篩選獲得T1代植 株，用基因 PCRW及RT-PCR分別在DNA和RNA水平上檢測目的基因是否轉(zhuǎn)入W及是否成功表 達(dá)，在DNAW及RNA水平均能擴(kuò)增獲得片段的則視為陽性轉(zhuǎn)化株，引物為
[0046] P3:5 '-CAGGATCTCAGAATGCCGGA-3 '
[0047] P4:5 ' -TGCCCTTMTTCATCTGCGC-3 '
[0048] 擴(kuò)DM擴(kuò)PCR鑒定82化p大小片段（圖2)。通過PCR鑒定可擴(kuò)增片段的T1代植株為候 選，再利用RT-PCR檢測，可擴(kuò)增出821bp片段的則為表達(dá)的T1陽性株（圖3)。收獲T1代轉(zhuǎn)基因 植株種子為T2代。將轉(zhuǎn)基因植株種子T2代播種于含有25mg/L卡那霉素的1/2MS培養(yǎng)基，挑選 綠色植株移栽至營養(yǎng)±中生長并用于抗病性鑒定。
[0049] (五)T2代轉(zhuǎn)化株的抗病性鑒定
[0050] 對(duì)LRK2基因可W正常表達(dá)的轉(zhuǎn)化株系進(jìn)行抗病性鑒定。將經(jīng)含有卡那霉素的1/ 2MS培養(yǎng)基篩選的綠苗轉(zhuǎn)入營養(yǎng)±中，每盆移栽1株幼苗。待擬南芥生長2周后進(jìn)行抗病性鑒 定。所用菌株分別為棉花黃萎菌落葉型強(qiáng)致病力菌株V991 (徐榮旗，汪佳妮，陳捷胤等.棉花 黃萎病菌T-DNA插入突變體表型特征和側(cè)翼序列分析.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010,43(3) :489- 496;張?zhí)煺?，周兆華，巧留芳，等.棉花對(duì)黃萎病的抗性遺傳模式及抗(耐)病品種的選育技 術(shù).作物學(xué)報(bào)，2000,26(6) :673-680)和非落葉型菌株BP2(Baolong Zhang,化wen Yang, Tianzi Chen et al. Island Cotton GbvelGene Encoding A Receptor-Like Protein Confers Resistance to Both Defoliating and Non-Defoliating Isolates of Vedicillium d址liae，PloS 0肥，7(12):e51091)。病原菌經(jīng)PDA平板活化后，從菌落邊緣 挑取菌塊放入PDB培養(yǎng)液，25°C，120r · min培養(yǎng)5-6d，用紗布過濾培養(yǎng)液，鏡檢并用血球計(jì) 數(shù)板計(jì)數(shù)，調(diào)整抱子濃度為1 X 1〇7，每種病原菌的鑒定株數(shù)40株，接種后每天觀察病害的發(fā) 生情況，在15天后就可W明顯看見發(fā)病癥狀，主要表現(xiàn)為葉片黃化，萎黨，生長延緩?？共⌒?鑒定結(jié)果顯示，對(duì)于落葉型黃萎病V991，對(duì)照野生型病指達(dá)到61.2%，而轉(zhuǎn)基因株系的平均 病指僅為18.95%;對(duì)于非落葉型黃萎病BP2,對(duì)照野生型病指達(dá)到55.7%，而轉(zhuǎn)基因株系 的平均病指僅為16.6 % (圖4，圖5)。進(jìn)一步提取發(fā)病擬南芥植株DNA，并通過PCR對(duì)發(fā)病的擬 南芥的菌絲進(jìn)行定量。數(shù)據(jù)顯示定量結(jié)果與表型一致，接種V991的轉(zhuǎn)基因植株中的菌絲含 量僅為野生型擬南芥18.73%，而接種BP2的轉(zhuǎn)基因植株中菌絲含量僅為野生型含量的 15.87% (圖6)。表明L服2可顯著增強(qiáng)擬南芥對(duì)落葉型菌系V991W及非落葉型菌系BP2的抗 性。
[0051 ]附錄：
[0052] 1.RNA提取方法
[0053] (1)取材料加液氮充分研磨成粉末狀轉(zhuǎn)運(yùn)至離屯、管中；
[0054] (2)加10倍體積的RNA提取緩沖液，震蕩混勻，50°C水浴約20min，中途可混合2-3 次；
[005引（3)加0.6倍體積的氯仿，混勻，靜置冰浴20min;
[0056] (4)12000巧m離屯、20min，將上清轉(zhuǎn)運(yùn)至一新離屯、管中；
[0057] (5)加1/2體積的SMLiCl溶液，冰浴過夜（1化W上）；
[0058] (6)120(Κ)巧m離屯、20min，棄上清，用70%酒精洗沉淀1次并將沉淀轉(zhuǎn)運(yùn)至一新的離 屯、管中；
[0059] (7)12000巧111離屯、2〇111；[]1，棄乙醇溶液，沉淀抽干2〇111；[]1;
[0060] (8)加200U1無 R化S e的水溶解沉淀，加1倍體積的水飽和酪/氯仿=1:1充分混勻， 靜置5min;
[0061] (9) 1200化pm離屯、20min，將上清轉(zhuǎn)運(yùn)至另一新的離屯、管中，再加1倍體積的水飽和 酪/氯仿=1:1重復(fù)抽提一次；
[0062] (10) 1200化pm離屯、20min，上清加1倍體積的氯仿抽提一次；
[0063] (11)12000巧111離屯、20111111，上清加1/^2體積81 ^0溶液，冰浴過夜（1化^上）；
[0064] (12)12000巧111離屯、20111111，沉淀用70%酒精洗一次。抽干后溶于100-200111無1?^36 的水中。取化1檢測質(zhì)量。
[006引 2.CDNA的合成
[0066] 將提取的RNA用DNasel 37°C純化處理30min后備用。用TransScript Reverse Transc;rip1:ase試劑盒（Transgen公司）合成第一鏈cDNA。體系如下： RNA 模板 ?.ΟμΙ^ 引物(500μιιιοΙμυ?) J.O.uL clNTPdOmmol.uL·') Ι.ΟμΙ.
[0067] 5\RTbu 化 r 4.0μΙ_. R化onucicasc Inhibhor(Rl) 0,.弓)_iL Transcript RT 1,.'0|止 DEPC ddH：0 補(bǔ)至 20.0μΙ>
[006引 42°C 45min，85°C 5min。于-20°C保存。
[0069] LRK2基因，其序列為沈Q ID NO.l:
[0070]

【主權(quán)項(xiàng)】
1. 賦予植物黃萎病抗性的LRK2基因，其序列為SEQ ID NO.l。2. 權(quán)利要求1所述LRK2基因的應(yīng)用。3. 權(quán)利要求1所述LRK2基因在植物黃萎病抗性中的的應(yīng)用。4. 權(quán)利要求1所述LRK2基因在擬南芥植物黃萎病抗性中的的應(yīng)用。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，包括： 1. LRK2基因的克隆以及植物表達(dá)載體的構(gòu)建 以陸地棉品種奧3503的cDNA為模板，用引物 PI:5 '-TGCTCTAGAATGGCATCTGTAATGAGTAA-3 '， P2:5 '-CGCGGATCCTCACAGATTGGATGTTGTG-3 ' 擴(kuò)增得到2016bp片段，將該片段命名為LRK2，PCR產(chǎn)物純化后用Xbal/BamHI酶切，連接 到pCambia2301載體，測序后成功構(gòu)建的重組載體命名為pCambia2301:LRK2; 2) 轉(zhuǎn)基因植株的獲得 將步驟1)中構(gòu)建好的pCambia2301: LRK2質(zhì)粒用凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404，用蘸花法 轉(zhuǎn)化擬南芥，當(dāng)代的擬南芥植株為T0代，收獲的種子為T1代，T1代種子在含25mg/mL卡那抗 生素的1/2MS培養(yǎng)基上篩選，獲得候選的陽性T1植株，分別在DNA和RNA水平上檢測目的基因 是否轉(zhuǎn)入以及是否成功表達(dá)： 用引物 P3:5 '-CAGGATCTCAGAATGCCGGA-3， P4:5 '-TGCCCTTAATTCATCTGCGC-3 ' 擴(kuò)增候選的陽性T1代植株的DNA和cDNA進(jìn)行PCR鑒定，在DNA和cDNA水平均能擴(kuò)增獲得 821bp大小片段的T1植株則為成功轉(zhuǎn)化LRK1的陽性轉(zhuǎn)基因植株。6. 權(quán)利要求5所述應(yīng)用中構(gòu)建的重組載體pCambia2301: LRK2。
【專利摘要】本發(fā)明涉及賦予植物黃萎病抗性的<i>LRK2</i>基因及應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。<i>LRK2</i>基因是從陸地棉品種奧3503品種中獲得的一個(gè)表面受體蛋白基因，<i>LRK2</i>完整編碼框長度為2016個(gè)堿基，編碼蛋白含671個(gè)氨基酸，分子量為74KD，等電點(diǎn)為7.85。<i>LRK2</i>轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)落葉型黃萎病菌V991以及非落葉型黃萎病菌BP2的抗病性明顯增強(qiáng)，轉(zhuǎn)基因擬南芥發(fā)病率均低于20%，而對(duì)照野生型發(fā)病率均大于50%。
【IPC分類】C12N15/82, A01H5/00, C12N15/29
【公開號(hào)】CN105586348
【申請?zhí)枴緾N201610112767
【發(fā)明人】劉廷利, 顧周航, 周雪平, 張保龍, 楊郁文, 陳天子, 凌溪鐵, 王金彥
【申請人】江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 浙江理工大學(xué)
【公開日】2016年5月18日
【申請日】2016年2月29日