一種藍(lán)細(xì)菌脂肪烴合成關(guān)鍵基因及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及能源微生物種質(zhì)資源與基因資源領(lǐng)域，具體而言是一種藍(lán)細(xì)菌脂肪姪 合成關(guān)鍵基因。
【背景技術(shù)】
[0002] 能源是現(xiàn)代工業(yè)的支柱，W化石燃料為代表的傳統(tǒng)能源的日益短缺是制約我國(guó)經(jīng) 濟(jì)可持續(xù)發(fā)展的瓶頸，可再生的生物燃料的應(yīng)用成為緩解能源危機(jī)并改善生態(tài)環(huán)境的最佳 選擇之一。在交通運(yùn)輸業(yè)中廣泛使用的汽油、柴油和航空煤油等化石燃料的主要成分是特 定鏈長(zhǎng)范圍的脂肪姪，脂肪姪具有高能量密度、低吸濕性、低揮發(fā)性、與現(xiàn)有發(fā)動(dòng)機(jī)相兼容 等優(yōu)點(diǎn)，是傳統(tǒng)石化液體燃料的最佳替代品化easling and化OU 2008)。
[0003] 石油、古代沉積物W及隅石中包含了大量可能為生物來(lái)源的物質(zhì)，其中脂肪姪也 是最受關(guān)注的成員之一?？茖W(xué)家曾針對(duì)傳統(tǒng)化石能源的起源提出了腐朽的藻類(lèi)細(xì)胞是其組 成成分的理論（Han and Calvin 1969)。而自上世紀(jì)六十年代末期開(kāi)始的關(guān)于藍(lán)細(xì)菌中脂 肪姪的研究主要是圍繞分析和鑒定不同藍(lán)細(xì)菌（或者其他真核藻類(lèi)）的脂肪姪組成和含 量展開(kāi)的。目前已報(bào)道的野生藍(lán)細(xì)菌中脂肪姪含量最低占細(xì)胞干重的0.01% (Winters et al. 1969)，最高可達(dá)0.26% (Coates et al. 2014)。研究發(fā)現(xiàn)其鏈長(zhǎng)主要集中于C15至C20 之間，且W C17為主化an et al. 1968)。
[0004] 作為新一代能源微生物系統(tǒng)，藍(lán)細(xì)菌具有W下優(yōu)勢(shì)；（1)與合成生物燃料的異養(yǎng) 微生物反應(yīng)器大腸桿菌、釀酒酵母等不同，藍(lán)細(xì)菌能夠利用太陽(yáng)能并可W二氧化碳作為碳 源生長(zhǎng)，具備種類(lèi)豐富、培養(yǎng)成本低、生命力強(qiáng)、生長(zhǎng)速率快等優(yōu)點(diǎn)。（2)從基因工程角度考 慮，與同樣可利用太陽(yáng)能和二氧化碳的真核微藻、高等植物不同，藍(lán)細(xì)菌作為合成脂肪姪的 宿主，其基因操作更為簡(jiǎn)易，可進(jìn)行大規(guī)模的遺傳改造。（3)藍(lán)細(xì)菌具有相對(duì)清晰的遺傳背 景。目前已公布了 130余株藍(lán)細(xì)菌的全基因組序列（Shih et al. 2013)。
[0005] 得益于分子生物學(xué)、生物信息學(xué)和代謝工程技術(shù)等的迅猛發(fā)展，目前已經(jīng)在藍(lán)細(xì) 菌中鑒定出兩條脂肪姪合成途徑。其一存在于多數(shù)藍(lán)細(xì)菌中，主要由脂醜醜基載體蛋白 還原酶（Fatty a巧；L-ac}d carrier protein reductase, AAR)和脂肪醒脫甲醜基加氧酶 (Fatty aldehyde deformylating oxygenase, ADO)催化完成，其產(chǎn)物主要為直鏈焼姪、側(cè) 鏈焼姪和帰姪（不飽和鍵位于碳鏈內(nèi)部HSchirmer et al.2010)。另一途徑存在于少數(shù)藍(lán) 細(xì)菌中，主要由末端帰姪合成酶（terminal olefin synthase,化巧催化完成，其產(chǎn)物為末端 帰姪（不飽和鍵位于碳鏈末尾）（Mendez-Perez et al.2011)。
[0006] 基于上述脂肪姪合成途徑的鑒定，目前已通過(guò)基因工程改造和代謝工程優(yōu)化提高 了重組藍(lán)細(xì)菌的脂肪姪產(chǎn)量。W集胞藻PCC 6803為例，研究結(jié)果證實(shí)，重組菌株的產(chǎn)量已 可達(dá)野生株的9倍W上（Wang et al. 2013)。但目前基因工程藍(lán)細(xì)菌合成脂肪姪的水平還 遠(yuǎn)未達(dá)到工業(yè)應(yīng)用的水平，產(chǎn)姪藍(lán)細(xì)菌種質(zhì)資源和基因資源的挖掘是進(jìn)一步提高藍(lán)細(xì)菌脂 肪姪合成效率與豐富產(chǎn)姪多樣性的重要因素之一。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明目的在于提供一種藍(lán)細(xì)菌脂肪姪合成關(guān)鍵基因。
[0008] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：
[0009] -種藍(lán)細(xì)菌產(chǎn)姪基因：產(chǎn)姪基因包括脂醜ACP還原酶的編碼基因（aar)和脂肪醒 脫甲醜基加氧酶的編碼基因（ado)。
[0010] 所述脂醜ACP還原酶的編碼基因（aar)和脂肪醒脫甲醜基加氧酶的編碼基因 (ado)為藍(lán)細(xì)菌 Nostoc calcicola FACHB 389，Leptolyngbya sp. NIES-30, Phormidium ambiguum NIES-2119, Chroogloeocystis siderophila NIES-1031， Calothrix sp. NIES-2101 或 Sc}ftonema sp. NIES-2130 的 aar 和 ado。
[0011] 所述脂醜ACP還原酶的編碼基因（aar)和脂肪醒脫甲醜基加氧酶的編碼基因 (ado)具有沈Q ID NO: 1 與 2、沈Q ID NO:3 與 4、沈Q ID NO:5 與 6、沈Q ID NO:7 與 8、沈Q ID NO:9與10或沈Q ID NO: 11與12所示的序列。
[0012] 一種構(gòu)建體，構(gòu)建體包含啟動(dòng)子，W及該啟動(dòng)子控制的脂醜ACP還原酶的編碼基 因（aar)和脂肪醒脫甲醜基加氧酶的編碼基因（ado)。
[0013] 所述構(gòu)建體的啟動(dòng)子為來(lái)源于藍(lán)細(xì)菌的化pcB啟動(dòng)子或來(lái)源于大腸桿菌的T7啟 動(dòng)子。
[0014] 所述脂醜ACP還原酶的編碼基因（aar)和脂肪醒脫甲醜基加氧酶的編碼基因 (ado)為藍(lán)細(xì)菌 Nostoc calcicola FACHB 389，Leptolyngbya sp.NIES-30, Phormidium ambiguum NIES-2119, Chroogloeocystis siderophila NIES-1031, Calothrix sp. NIES-2101 或 Sc}ftonema sp. NIES-2130 的 aar 和 ado。
[0015] 一種能合成脂肪姪的基因工程菌，工程菌包含上述構(gòu)建體。
[0016] 進(jìn)一步的說(shuō)是，將所述構(gòu)建體通過(guò)轉(zhuǎn)化導(dǎo)入大腸桿菌中。
[0017] 更進(jìn)一步的說(shuō)是，將所述構(gòu)建體通過(guò)轉(zhuǎn)化導(dǎo)入大腸桿菌化21 (DE3)化祀突變株 中。
[0018] 一種所述的藍(lán)細(xì)菌產(chǎn)姪基因作為合成脂肪姪的應(yīng)用中。
[0019] 本發(fā)明所具有的有益效果：
[0020] W藍(lán)細(xì)菌作為微生物表達(dá)系統(tǒng)合成脂肪姪，是利用太陽(yáng)能固定二氧化碳合成生物 燃料的過(guò)程。該過(guò)程是清潔生物能源的生產(chǎn)過(guò)程，不受原料不足的制約，不會(huì)增加碳排放。 本發(fā)明的技術(shù)方案可為上述生物能源制備過(guò)程提供有價(jià)值的候選基因資源。
[0021] 同時(shí)，藍(lán)細(xì)菌產(chǎn)姪關(guān)鍵基因（脂醜ACP還原酶/脂肪醒脫甲醜基加氧酶編碼基因） 的克隆有W下重要作用；一、為從分子水平上深入研究藍(lán)細(xì)菌脂肪姪合成的代謝機(jī)制和藍(lán) 細(xì)菌胞內(nèi)脂肪姪的生理功能奠定了基礎(chǔ)。二、可了解不同藍(lán)細(xì)菌菌株的產(chǎn)姪特性，并解析不 同結(jié)構(gòu)脂肪姪在藍(lán)細(xì)菌中的分布規(guī)律。
[0022] 因此，本發(fā)明通過(guò)廣泛收集藍(lán)細(xì)菌菌種資源，并借助全基因組測(cè)序和產(chǎn)姪基因克 隆，旨在為用太陽(yáng)能、二氧化碳和水直接合成脂肪姪的藍(lán)細(xì)菌液體燃料合成體系提供候選 種質(zhì)和基因資源。
【附圖說(shuō)明】
[0023] 圖1為基于GC-MS測(cè)定的藻株Nostoc calcicola FACHB 389的脂肪姪組成和特 性。
[0024] 圖2為基于GC-MS測(cè)定的藻株Leptolyngbya sp. NIES-30的脂肪姪組成和特性。 [00巧]圖3為基于GC-MS測(cè)定的藻株化ormidium ambiguum NIES-2119的脂肪姪組成和 特性。
[0026] 圖 4 為基于 GC-MS 測(cè)定的藻株 Qiroogloeo巧stis siderophila NIES-1031 的脂 肪姪組成和特性。
[0027] 圖5為基于GC-MS測(cè)定的藻株化lot虹ix sp. NIES-2101的脂肪姪組成和特性。
[0028] 圖6為基于GC-MS測(cè)定的藻株S^tonema sp. NIES-2130的脂肪姪組成和特性。
[0029] 圖7為重組載體PTZ60的基本結(jié)構(gòu)。重組載體PTZ60是W 389-1/2為引物， WNostoc calcicola FACHB 389基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增出2065bp片段，克隆入 pEASY-blunt載體，轉(zhuǎn)化E. coli Transl-Tl瞻菌體抗性感受態(tài)細(xì)胞而獲得。
[0030] 圖8為重組載體ρΤΖ61的基本結(jié)構(gòu)。重組載體ρΤΖ61是W 30-1 /2為引物， W Leptolyngbya sp. NIES-30基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增出1949bp片段，克隆入 pEASY-blunt載體，轉(zhuǎn)化E. coli Transl-Tl瞻菌體抗性感受態(tài)細(xì)胞而獲得。
[0031] 圖9為重組載體PTZ62的基本結(jié)構(gòu)。重組載體PTZ62是W 2119-1/2為引物，W Phormidium ambiguum NIES-2119基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增出1914bp片段，克隆入 pEASY-blunt載體，轉(zhuǎn)化E. coli Transl-Tl瞻菌體抗性感受態(tài)細(xì)胞而獲得。
[0032] 圖10為重組載體PTZ63的基本結(jié)構(gòu)。重組載體PTZ63是W 1031-1/2為引物，W Qiroogloeo巧stis siderophila NIES-1031 基因組 DNA 為模板，PCR 擴(kuò)增出 19nbp 片段， 克隆入pEASY-blunt載體，轉(zhuǎn)化E. coli Transl-Tl瞻菌體抗性感受態(tài)細(xì)胞而獲得。
[0033] 圖11為重組載體PTZ64的基本結(jié)構(gòu)。重組載體PTZ64是W 2101-1/2為引物，W Calot虹ix sp. NIES-2101基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增出183化P片段，克隆入祀ASY-blunt 載體，轉(zhuǎn)化E. coli Transl-Tl瞻菌體抗性感受態(tài)細(xì)胞而獲得。
[0034] 圖12為重組載體PTZ65的基本結(jié)構(gòu)。重組載體PTZ65是W 2130-1/2為引物，W S巧tonema sp. NIES-2130基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增出1887bp片段，克隆入祀ASY-blunt 載體，轉(zhuǎn)化E. coli化ansl-Tl瞻菌體抗性感受態(tài)細(xì)胞而獲得。
[0035] 圖13為重組載體ρΤΖ68的基本結(jié)構(gòu)。WBamH I和化0 I酶切ρΤΖ60并回收Nostoc calcicola FACHB 389的產(chǎn)姪基因片段ado-aar, WBamH I和化〇 I酶切祀T2化并回收載 體部分，兩者連接構(gòu)建獲得重組質(zhì)粒PTZ68。
[0036] 圖14為重組載體PTZ69的基本結(jié)構(gòu)。W BamH I和化0 I酶切PTZ61并回收 Leptolyngbya sp.NIES-30 的產(chǎn)姪基因片段 ado-aar, WBamH I 和)(ho I 酶切祀T2化并回 收載體部分，兩者連接構(gòu)建獲得重組質(zhì)粒PTZ69。
[0037] 圖15為重組載體PTZ70的基本結(jié)構(gòu)。WBamH I和化0 I酶切PTZ62并回收 Phormidium ambiguum NIES-2119 的產(chǎn)姪基因片段ado-aar, WBamH I 和化〇 I 酶切祀T2化 并回收載體部分，兩者連接構(gòu)建獲得重組質(zhì)粒PTZ70。
[0038] 圖16為重組載體PTZ71的基本結(jié)構(gòu)。W BamH I和化0 I酶切PTZ63并回收 Qiroogloeoc^ystis siderophila NIES-1031 的產(chǎn)姪基因片