0079] PLV-U6-EGFP-化ro慢病毒載體U6啟動(dòng)子下游只包含Bamm和EcoRI。但運(yùn)兩個(gè)有限 的酶切位點(diǎn)限制了構(gòu)建同時(shí)表達(dá)RNA和蛋白質(zhì)雙功能慢病毒表達(dá)載體。為解決運(yùn)一問題，設(shè) 計(jì)一段多克隆位點(diǎn)序列(MCS)并用此序列置換BamHI和EcoRI之間的序列，該段多克隆位點(diǎn) 序列的DNA序列如SEQ N0.ID:3所示。利用擎科公司合成的此DNA片段的正反鏈，各取2微升 25μΜ DNA片段混合，加雙蒸水至終體積2化L，在PCR儀中95°C下進(jìn)行變性5分鐘、接著在37°C 下退火30分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，取10化反應(yīng)物，分別加入0.化L BamH I和EcoRI限制性酶至反 應(yīng)物中，在37 °C下進(jìn)行酶切反應(yīng)1 -2小時(shí)。同時(shí)，取liig突變了趾01和Xba I位點(diǎn)的PLV-U6- EGFP-puro質(zhì)粒用BamHI和EcoRI進(jìn)行酶切。
[0080] 待酶切完成后，將樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，利用Axygen公司膠回收試劑盒回收 多克隆位點(diǎn)的DNA片段和pLV-U6-EGFP-puro (mXho I+mXba I)載體。取化L載體和化1多克隆位 點(diǎn)片段利用Promega公司連接酶和方法進(jìn)行連接反應(yīng)。
[0081 ]取化L連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化化Iblue感受態(tài)細(xì)胞(細(xì)菌），待克?。ň?長至18小時(shí)，挑取 菌落接菌在LB培養(yǎng)液中，置37°C搖床上搖菌過夜。第二天收集菌體并用Axygen試劑盒提取 質(zhì)粒。利用多克隆位點(diǎn)代表性的酶如8曰111陽，60)1?1，乂}1〇1，乂6曰1和齡《對(duì)所提取的質(zhì)粒進(jìn)行 酶切鑒定，如圖3所示，克隆了多克隆位點(diǎn)DNA片段的質(zhì)粒能夠被BamHI，ECORI，XhoI，XbaI和 Notl切割成線性分子形成一條帶，而沒有被酶切割的質(zhì)粒表現(xiàn)出多于2條帶;說明新載體中 分別包含單個(gè)的BamHI，EcoRI，化〇1，XbaI和Notl酶切位點(diǎn)，提示多克隆位點(diǎn)片段已連接到 載體中。
[0082] 為了進(jìn)一步確定多克隆位點(diǎn)的DNA片段已被克隆到載體中。我們將酶切鑒定的質(zhì) 粒進(jìn)行測(cè)序分析(擎科公司），圖3B所示，多克隆位點(diǎn)DNA序列確實(shí)連接到載體中。
[0083] 經(jīng)基因克隆、酶切鑒定和測(cè)序分析(見說明書附圖3)，我們獲得了包含多克隆位點(diǎn) 的新慢病毒表達(dá)載體pLV-U6-MCS--EGFP-Puro。新載體的多克隆位點(diǎn)包含了 BamHI、Pme I、 Notl、HpaI、XhoI、SmaI、XbaI、BclI、EcoRI (圖3)。運(yùn)些位點(diǎn)為克隆和表達(dá)非編碼RNA提供了 位點(diǎn)多樣性的選擇。
[0084] 含多克隆位點(diǎn)的化V-U6-MCS--EGFP-化ro慢病毒載體的核巧酸序列如序列表SEQ ID NO. 11的核巧酸序列所示。
[0085] 含多克隆位點(diǎn)的pLV-U6-MCS--EGFP-Puro慢病毒載體的酶切鑒定試驗(yàn)見說明書附 圖圖3。
[0086] 經(jīng)過DNA測(cè)序，包含多克隆位點(diǎn)的PLV-U6-MCS--EGFP-化ro慢病毒載體的DNA序列 特征為：在序列表SEQ ID N0:2的BamHI酶切位點(diǎn)與EcoRI酶切位點(diǎn)之間，插入MCS的DNA序 列，即在沈QIDN0:2的化p至22bp之間插入MCS片段(SEQIDN0:3)后，得到含有多個(gè)克隆 位點(diǎn)的pLV-U6-MCS-EGFP-Puro慢病毒載體的DNA序列。MCS的核巧酸序列如序列表SEQ ID N0:3的核巧酸序列所示。
[0087] 實(shí)施例五既可表達(dá)RNA又可表達(dá)蛋白質(zhì)的雙功能慢病毒表達(dá)載體化V-U6-CMV-- EGFP-Puro的構(gòu)建
[0088] 為構(gòu)建表達(dá)RNA和表達(dá)蛋白質(zhì)的雙功能慢病毒表達(dá)載體。在新慢病毒表達(dá)載體 PLV-U6-MCS--EGFP-化ro多克隆位點(diǎn)（MCS)中插入CMV啟動(dòng)子，CMV啟動(dòng)子序列的Genbank序 列號(hào)為GenBank:抓015377.1，可在NCBI的核酸庫中使用該序列號(hào)捜索獲得。CMV啟動(dòng)子通過 常規(guī)的pcDNA表達(dá)載體(購自賽默飛公司）用帶Notl和化〇1酶切位點(diǎn)的引物進(jìn)行PCR后獲得， PCR 引物為:CMVF 和 CMVR。
[0089] 引物CMVF的核巧酸序列如序列表SEQ ID N0:7所示。
[0090] 引物CMVR的核巧酸序列如序列表SEQ ID N0:8所示。
[0091] PCR產(chǎn)物和pLV-U6-MCS--EGFP-Puro經(jīng)Not巧日趾ol酶切后，用Axygen公司的DNA膠 回收試劑盒回收DNA，將CMV片段(3微升）與Not巧日趾〇1酶切的PLV-U6-MCS-EGFP-化ro (1微 升)連接。取3微升連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化化Iblue感受態(tài)細(xì)胞，搖菌并提取質(zhì)粒后用Not I和趾〇1酶 進(jìn)行酶切分析。如圖4A所示，新提取的質(zhì)粒經(jīng)Notl和化〇1雙酶切電泳后獲得兩條帶，一條帶 (8.4kb)和線性化的載體大小一致，另一條帶約72化P DNA片段，說明CMV啟動(dòng)子序列被克隆 到載體上;此載體被BamHI，EC0RI，化oI，XbaI和Notl切割成線性分子形成一條帶，說明它只 包含運(yùn)些酶的一個(gè)酶切位點(diǎn)。至此，原載體經(jīng)突變，插入多克隆位點(diǎn)，再利用多克隆位點(diǎn)插 入CMV啟動(dòng)子(表達(dá)蛋白的啟動(dòng)子），獲得了可W表達(dá)蛋白質(zhì)慢病毒表達(dá)載體;另外，由于U6 啟動(dòng)子下游存在BamHI，化eI，NotI酶切位點(diǎn)方便克隆非編碼RNA(圖4B)，因此新載體pLV- U6-CMV--EGFP-Puro是具有可能表達(dá)RNA和蛋白質(zhì)的雙功能慢病毒載體。
[0092] 表達(dá)蛋白和RNA的雙功能慢病毒新表達(dá)載體PLV-U6-CMV--EGFP-化ro的酶切實(shí)驗(yàn) 驗(yàn)證結(jié)果和結(jié)構(gòu)示意圖見說明書附圖圖4。
[0093] 經(jīng)過DNA測(cè)序，雙功能慢病毒新表達(dá)載體pLV-U6-CMV--EGFP-Puro的DNA序列為沈Q ID NO: 4所示;其初級(jí)結(jié)構(gòu)示意圖如說明書附圖化所示。
[0094] 該新載體的特點(diǎn)是，U6啟動(dòng)子下游存在BamHI Jme巧日Notl酶切位點(diǎn)，方便非編碼 RNA克隆在此處。CMV啟動(dòng)子（?？诒磉_(dá)蛋白的啟動(dòng)子）下游存在趾oI、SmaI、XbaI、BclI、 EcoRI等多個(gè)酶切位點(diǎn)，方便克隆表達(dá)蛋白的基因（圖4b)。因?yàn)榫幋a蛋白的基因常常含有一 些常用的酶切位點(diǎn)，本載體有多個(gè)可供選擇的酶切位點(diǎn)，為克隆基因提供了方便。
[0095] 實(shí)施例六雙功能慢病毒表達(dá)載體PLV-U6-CMV--EGFP-化ro的RNA表達(dá)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)和 蛋白表達(dá)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)
[0096] 為了排除將原載體Xhol和Xbal位點(diǎn)的突變對(duì)慢病毒載體整合功能的影響（注:慢 病毒載體具有將攜帶的基因整合到細(xì)胞基因組中的功能），對(duì)表達(dá)篩選基因如EGFP和化ro (嚷嶺霉素）導(dǎo)致的可能損害，W及對(duì)新載體U6和CMV表達(dá)功能的鑒定，分別進(jìn)行RNA表達(dá)驗(yàn) 證實(shí)驗(yàn)和蛋白表達(dá)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。
[0097] 1、RNA表達(dá)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)
[0098] 為了將編碼干擾beta-tubulin基因表達(dá)shRNA cDNA片段克隆在新載體上，利用 shRNA設(shè)計(jì)軟件(Gene Link website)設(shè)計(jì)了干擾細(xì)胞beta-tubulin表達(dá)的shRNA(siRNA) 的cDNA序列（如序列表SEQ ID NO: 12-17))，編碼shRNA的DNA序列由擎科公司合成。運(yùn)些序 列兩端加上BamHI和Notl位點(diǎn)便于克隆到化V-U6-CMV--EGFP-化ro載體U6啟動(dòng)子的下游。 shRNAcDNA克隆按照前面所描述的方法進(jìn)行.
[0099] 將克隆了干擾beta-tubulin表達(dá)的shRNA慢病毒載體或者表達(dá)對(duì)照shRNA慢病毒 載體（由本領(lǐng)域常規(guī)方法制備)分別與包裝輔助載體PH1和P肥按照等摩爾數(shù)的DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)染 293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染試劑購自化ermo Scientific的化rbofect,轉(zhuǎn)染方法按照化rbofect說明書 進(jìn)行。轉(zhuǎn)染后第3天加終濃度25微克每毫升培養(yǎng)液的puromycin進(jìn)行篩選，具有抗性的細(xì)胞 將繼續(xù)生長增殖。待細(xì)胞長至一定數(shù)量(超過3xl06細(xì)胞），收獲細(xì)胞，用IxSDS上樣緩沖液裂 解細(xì)胞，將獲得的樣品進(jìn)行聚丙締聚丙締酷胺凝膠電泳和Western Blot分析，聚丙締聚丙 締酷胺凝膠電泳和Western Blot按照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》(作者：〔美)J.薩姆布魯克等，科 學(xué)出版社2008年出版)所描述的標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行，檢測(cè)beta-tubulin和act in的一抗，購自 Abeam公司，W1/1000濃度進(jìn)行檢測(cè)；二抗購自Sigma公司，W1/2000濃度進(jìn)行。，免疫印跡通 過E化試劑盒（Thermo Scientific) W及X-光片顯影、定影完成（Thermo Scientific)。 Western blot結(jié)果如圖5a所示，與對(duì)照shRNA相比，表達(dá)干擾化bulin表達(dá)的shRNA的293T細(xì) 胞，tubulin的蛋白水平明顯降低，說明細(xì)胞中beta-tubulin的表達(dá)被其表達(dá)的shRNA干擾 導(dǎo)致表達(dá)水平降低;而另一種對(duì)照蛋白-Actin的表達(dá)則不受影響，即tubulin shRNA和對(duì)照 ShRNA樣品的Actin表達(dá)水平是一樣的。實(shí)驗(yàn)說明新載體上的U6啟動(dòng)子具有表達(dá)非編碼RNA (如shRNA)的功能。
[0100] 載體PLV-U6-CMV--EGFP-化ro的tubulin shRNA表達(dá)的免疫印跡結(jié)果見說明書附 圖5A。
[0101] 2、蛋白表達(dá)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)
[0102] 用PCR擴(kuò)增編碼beta-tubulin的基因并在5'端加上HA標(biāo)簽克隆到新載體PLV-U6- CMV-EGFP-Puro CMV下游的趾〇1 與EcoRI位點(diǎn)之間。PCR引物如下。b-tubulincloF〇(ho I) 引物序列如序列表SEQ ID NO:9所示；
[0103] 6-化扣1111(31〇1?化(3〇1?1)引物序列如序列表沈9 10備:10所示
[0104] PCR、基因克隆按照實(shí)施例Ξ的方法進(jìn)行。將克隆了 HA-beta-tubulin的新載體進(jìn) 行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染或與病毒包裝輔助載體共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染試劑turbofect購自化ermo Scientific公司，轉(zhuǎn)染方法按照該公司產(chǎn)品說明書公開的方法進(jìn)行。轉(zhuǎn)染兩天后，將培養(yǎng)皿 置于巧光顯微鏡進(jìn)行觀察，觀察細(xì)胞中EGFP