一種與胃癌相關(guān)的血清/血漿lncRNA標(biāo)志物試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程及腫瘤學(xué)領(lǐng)域，設(shè)及一種與胃癌相關(guān)的血清/血漿IncRNA標(biāo) 志物試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 胃癌是世界第二高發(fā)腫瘤，同時也是胃腸道腫瘤中最常見腫瘤之一。盡管胃癌惡 性程度較高，但若能早期發(fā)現(xiàn)早期治療，仍可獲得最佳治療效果，早期胃癌手術(shù)切除率為 90%-100%，5年生存率可達70%-100%，與進展期胃癌相比，兩者治療效果存在著巨大的 反差。但大部分患者就診時已處于晚期。目前對胃癌的生物學(xué)標(biāo)志進行了大量而廣泛的研 究，包括基因標(biāo)記、血清學(xué)標(biāo)記和細(xì)胞學(xué)標(biāo)記等，由于運些指標(biāo)的特異性和敏感性各有差 異，對于早期胃癌目前還沒有準(zhǔn)確有效的篩查方法，也缺乏可靠的診斷措施。由鑒于此，胃 癌早期診斷率亟待提高，尋找有效的標(biāo)志物對胃癌早期診斷、促進其預(yù)后有重要意義。
[0003] 非編碼RNA(ncRNA)是近年來腫瘤分子生物學(xué)研究領(lǐng)域的一個熱點，它分為miRNA 和IncRNAeLncRNA廣泛存在于真核生物中，是一組不編碼蛋白質(zhì)的長度超過200nt的RNA分 子，本身不具有開放閱讀框，且具有高度保守性、時序性和組織特異性，通過與祀mRNA結(jié)合， 降解或者抑制mRNA的翻譯導(dǎo)致祀基因的轉(zhuǎn)錄后沉默，從而調(diào)節(jié)生物體內(nèi)在的與機體生長、 發(fā)育、疾病發(fā)生過程有關(guān)的基因的表達。
[0004] 在本發(fā)明作出之前，近年來，IncRNA與腫瘤的關(guān)系已經(jīng)成為研究的熱點和焦點，已 經(jīng)發(fā)現(xiàn)IncRNA通過與基因的共表達和肺癌、乳腺癌、胃癌、膜腺癌等發(fā)病高度相關(guān)。研究已 經(jīng)證實血清/血漿中存在著幾百種IncRNAs，運些長鏈分子性質(zhì)穩(wěn)定，含量豐富且不會降解， 易于定量檢測，并存在著顯著的疾病特異性。血清/血漿IncRNA作為腫瘤診斷和預(yù)后分子標(biāo) 志物不僅創(chuàng)傷小，方法便捷，還能改進疾病診斷，腫瘤分類，預(yù)后估計、療效及復(fù)發(fā)預(yù)測的準(zhǔn) 確度。但是，血清/血漿IncRNA的表達量還是相對較低，若無標(biāo)準(zhǔn)化試劑盒的規(guī)范化步驟，血 清/血漿IncRNA不易檢出，失去早期診斷的可能；另一方面，僅采用一種血清/血漿IncRNA作 為腫瘤標(biāo)志物往往特異性不足，因僅采用一種血清/血漿IncRNA作為腫瘤標(biāo)志物試劑盒敏 感度和特異度均較低，從而導(dǎo)致早期胃癌診斷的錯診率和漏診率大大增加。沒有用于早期 胃癌患者血清學(xué)診斷的較為穩(wěn)定的生物標(biāo)志物，就不能篩選出胃癌異常表達的血清/血漿 IncRNAs作為生物標(biāo)志物，并研制相應(yīng)的診斷試劑盒。

【發(fā)明內(nèi)容】

[000引本發(fā)明的目的就在于克服上述缺陷，提出一種與胃癌相關(guān)的血清/血漿IncRNA標(biāo) 志物試劑盒。
[0006] -種與胃癌相關(guān)的血清/血漿IncRNA標(biāo)志物試劑盒，其主要技術(shù)特征在于血清/血 漿IncRNA標(biāo)志物為MALAT1和冊TAIR的組合。
[0007] 所述該引物為MALAn和冊TAIR的引物，其中MALAT1的上下游引物序列是SEQ No. 1 和沈Q No.2;冊TAIR的上下游引物序列是沈Q No.3和沈Q No.4。
[000引所述該試劑盒用于檢測血清/血漿中MALATl和冊TAIR。
[0009] 所述該試劑盒還包括PCR反應(yīng)常用的酶和試劑。
[0010] 本發(fā)明的有益效果：
[0011] 本發(fā)明提供的血清/血漿IncRNA標(biāo)志物作為胃癌診斷的標(biāo)志物的優(yōu)越性在于：
[0012] (1)血清/血漿IncRNA是一種新型生物標(biāo)志物，區(qū)別于傳統(tǒng)生物標(biāo)志物，不僅穩(wěn)定、 微創(chuàng)、易于檢測，且定量精確，將大大提高疾病診斷的敏感性和特異性，該類IncRNA生物標(biāo) 志物的成功開發(fā)有助于胃癌的輔助診斷，為其他疾病生物標(biāo)志物的研制提供借鑒。
[0013] (2)血清/血漿IncRNAs試劑盒是一種系統(tǒng)、全面的診斷和監(jiān)測試劑盒，可用于胃癌 患者的輔助診斷，有助于反映胃癌患者的疾病狀態(tài)，為臨床醫(yī)生快速準(zhǔn)確掌握患者病情、及 時采取更具個體化的防治方案提供支持。
[0014] (3)采用嚴(yán)密的設(shè)計和評價體系，本發(fā)明人采用IncRNA忍片檢測W獲取疾病特異 和異常表達的血清/血漿IncRNAs表達譜，并應(yīng)用qRT-PCR的方法進行單個驗證，采用了染料 法進行驗證；W上方法和策略的應(yīng)用加速和保證了血清/血漿IncRNAs生物標(biāo)志物和診斷試 劑盒的應(yīng)用，也為其他疾病生物標(biāo)志物的研制提供方法和策略上的借鑒。
[0015] 本發(fā)明優(yōu)點為通過控制年齡和性別等對疾病發(fā)展的影響因素，研究血清/血漿 IncRNA在胃癌輔助診斷的應(yīng)用前景，闡述異常表達的IncRNAs生物標(biāo)志物和診斷試劑盒的 研制和應(yīng)用，可使胃癌的診斷更加方便易行，為臨床醫(yī)生快速準(zhǔn)確掌握患者病情，為臨床治 療效果評價奠定基礎(chǔ)，并為發(fā)現(xiàn)具有潛在治療價值的新型小分子藥物祀標(biāo)提供幫助。
【附圖說明】
[0016] 圖1--顯不胃癌病例組和健康人對照組IncRNA的柱狀不意圖，其中A為胃癌病例 組和健康人對照組血清MALAT1表達圖，B為胃癌病例組和健康人對照組血清冊TAIR圖。
[0017] 圖2--顯示AUC曲線（A)MALAT1(B)H0TAIR(C)聯(lián)合示意圖，其中，A為胃癌患者 MALAT1的AUC曲線，曲線下面積為0.8 4 9 ; B為胃癌患者HOT AIR的AUC曲線，曲線下面積為 0.752;C為胃癌患者MALAT1和冊TAIR聯(lián)合AUC曲線，曲線下面積為0.869。
【具體實施方式】
[0018] 本發(fā)明的技術(shù)思路是：
[0019] W標(biāo)準(zhǔn)操作程序(SOP)采集符合標(biāo)準(zhǔn)的血液樣本，系統(tǒng)收集完整的人口學(xué)資料、臨 床資料等（運些資料可用于判斷疾病進展，并控制患者年齡和性別等因素對于發(fā)病的影 響），并采用RT-PCR、Rea^time PCR方法、LncRNA microarray忍片檢測等。
[0020] 具體地說，本發(fā)明解決問題的技術(shù)方案包括：
[0021] (1)建立統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)的標(biāo)本庫和數(shù)據(jù)庫：W標(biāo)準(zhǔn)操作程序(SOP)采集符合標(biāo)準(zhǔn)的血液 樣本，系統(tǒng)收集完整的人口學(xué)資料和臨床資料。
[0022] (2)血清/血漿IncRNA差異表達譜分析:選擇胃癌病例、與胃癌病例年齡、性別匹配 的健康人對照，檢測其血清/血漿IncRNA表達譜及含量，分析胃癌病例和健康人對照間血 清/血漿IncRNA的共性和特性，篩選差異表達IncRNAs，進行進一步單個樣本驗證，確定胃癌 發(fā)病相關(guān)血清/血漿IncRNAs。
[0023] (3)血清/血漿IncRNA篩查和診斷試劑盒的研制:根據(jù)胃癌病例和健康人對照的特 異血清/血漿IncRNA開發(fā)IncRNAs診斷試劑盒。
[0024] 本發(fā)明的目的是通過下列技術(shù)方案實現(xiàn)的：
[0025] 一種與胃癌相關(guān)的血清/血漿IncRNA標(biāo)志物，該標(biāo)志物為MALAT1和冊TAIR的組合。
[0026] 所述的血清/血漿IncRNA標(biāo)志物的引物，運些引物為：
[0027] ]^1^\1'1的引物為沈9齡.1和沈9齡.2;冊了41如勺引物為沈9齡.3和沈9齡.4。
[0028] 所述的血清/血漿IncRNA標(biāo)志物在制備胃癌輔助診斷試劑盒中的應(yīng)用。
[0029] 所述的血清/血漿IncRNA標(biāo)志物的引物在制備胃癌輔助診斷試劑盒中的應(yīng)用。一 種胃癌輔助診斷試劑盒，該試劑盒用于檢測血清/血漿中MALAT1和冊TAIR。所述的診斷試劑 盒，該試劑盒含有血清/血漿IncRNA中MLAT1和冊TAIR的引物。
[0030] 所述的診斷試劑盒，該試劑盒含有的血清/血漿IncRNA標(biāo)志物的引物為：
[0031 ] MALATl的引物為沈QNo.l和沈QNo.2;冊TAIR的引物為沈QNo.3和沈QNo.4。
[0032] 所述診斷試劑盒還可W包括PCR反應(yīng)常用的酶和試劑，如逆轉(zhuǎn)錄酶，緩沖液， dNTPs，Mgc 12，DEPC水和化q酶等;還可W含有標(biāo)準(zhǔn)品和/或?qū)φ掌贰?br>[0033] 具體來說主要包括W下幾個部分：
[0034] 1.研究樣本的選擇
[0CX3日](1)經(jīng)病理學(xué)明確診斷的胃癌病例
[0036] (2)采血前未經(jīng)過手術(shù)和化療，無手術(shù)前放化療
[0037] (3)與病例年齡、性別匹配的健康人對照
[0038] 本研究共采用6例符合標(biāo)準(zhǔn)的樣本進行研究。
[0039] 2. Trizol試劑（Invi trogen，Carl sbad，CA)提取血清/血漿總RNA，按常規(guī)方法操 作。通常能得到~加曲NA/50ml血清/血漿。
[0040] 3丄ncRNA microarray忍片檢測（歐易公司）
[0041 ] (1)總RNA通過逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA樣品
[0042] (2)cDNA樣品進行預(yù)擴增反應(yīng)
[0043] (3)預(yù)擴增產(chǎn)物進行LncRNA microarray忍片檢測，得到IncRNA的表達譜
[0044] (4)數(shù)據(jù)分析和處理
[004引 4.Real-time RT-PCR(qRT-PCR)方法
[0046] (1)取受試者的血清/血漿總RNA，通過RNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA樣品
[0047] (2)設(shè)計引物
[0048] (3)加入巧光探針或染料進行PCR反應(yīng)
[0049 ] (4)檢測并比較胃癌病例與健康人對照血清/血漿樣本中IncRNA的量的變化。
[0050] 5.診斷試劑盒制備方法
[0051 ] LncRNA microarray忍片檢測方法綜合確定胃癌病例和健康人對照中有拷貝差異 和表達差異，通過qRT-PCR技術(shù)篩選在胃癌病例和健康人對照中表達量和差異程度大的一 組血清/血漿IncRNA,作為胃癌輔助診斷的指標(biāo)。最后篩選出的與胃癌發(fā)病有關(guān)的血清/血 漿IncRNA組成診斷試劑盒(MALAT1和冊TAIR)。診斷試劑盒可W包括運些血清/血漿IncRNA 組合的引物，探針，W及化q酶，dNTP等試劑。
[0052] 6.統(tǒng)計分析方法
[0053] 運用X2檢驗（用于分類變量）或者student t檢驗（用于連續(xù)性變量），比較人口學(xué) 特征、組織類型和IncRNA平均表達水平在研究對象組間分布的差異。
[0054]我們在3例胃癌病例和3例健康人對照中運用LncRNA microarray忍片的研究結(jié)果 發(fā)現(xiàn)有5種IncRNAs與胃癌發(fā)病情況有顯著關(guān)聯(lián)。個體IncRNAs檢測的不同表達水平 表示，其中A Ct = Cw#，我們在每一個樣本提取時加入GAPDH作為參照，計算相對表達 量。對有統(tǒng)計學(xué)顯著差異的IncRNAs在3例胃癌病例和3例對照中進行單個驗證，進而觀察本 研究結(jié)果的穩(wěn)定程度。
[005引 W下是本發(fā)明進一步說明：
[0056] 在上述3例符合條件的胃癌病例及3例健康人對照中，兩組年齡按個體精確匹配。 我們將運兩組人群作為探索性樣本IncRNA忍片檢測獲得相關(guān)結(jié)果。
[0057] 根據(jù)IncRNA忍片檢測，檢測到在胃癌病例組和健康人對照組的血清中存在差異表 達（Δ ACT>2)的長鏈非編碼RNA:MALAT1、冊TAIR、H19。
[005引選擇在胃癌病例組和健康人對照組中CT值均小于35的IncRNA, W提高檢測效率， 滿足上述條件的IncRNAs包括:MALAT1，冊TAIR，H19和MEG3。SYBR染料法qRT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)在 3例胃癌病例和3例健康人對照中，冊TAIR和MLAT1在胃癌病例組和健康對照組中表達情況 存在顯著性差異。多因素 Logistic回歸分析結(jié)果表明，運兩種IncRNAs的表達水平均與胃癌 的發(fā)病存在著顯著關(guān)聯(lián)，即MALAT1和冊TAIR在病例組中均明顯高表達。
[0059] 根據(jù)上述結(jié)果，將運兩種與胃癌發(fā)病相關(guān)的IncRNAs在60例胃癌病例和60例健康 人對照中進一步的單個驗證。發(fā)現(xiàn)血清/血