一種馬鈴薯轉(zhuǎn)基因成分的檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物檢測領(lǐng)域，特別設(shè)及一種馬鈴馨轉(zhuǎn)基因成分的檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 馬鈴馨是我國主要作物，馬鈴馨的轉(zhuǎn)基因技術(shù)已成熟，需要對轉(zhuǎn)基因馬鈴馨的推 廣進(jìn)行監(jiān)管，轉(zhuǎn)基因成分檢測是轉(zhuǎn)基因監(jiān)管的技術(shù)支撐。
[0003] 現(xiàn)有的轉(zhuǎn)基因成分檢測技術(shù)主要檢測核酸或蛋白質(zhì)，其中，基于核酸的檢測方法 主要流程為：提取待測樣品中的核酸，利用PCR^olymerase化ainReaction，聚合酶鏈反應(yīng)） 的方法擴增樣品中的轉(zhuǎn)基因成分，利用實時定量、瓊脂糖電泳或忍片技術(shù)檢測轉(zhuǎn)基因成分 是否存在。
[0004] 在實現(xiàn)本發(fā)明的過程中，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有技術(shù)至少存在W下問題中的一種：
[0005] 轉(zhuǎn)基因成分多種多樣，而現(xiàn)有技術(shù)一次只能檢測其中一種或少數(shù)幾種，因此，需要 對可能的多種轉(zhuǎn)基因成份逐一進(jìn)行檢測，才能確定為"非轉(zhuǎn)基因"產(chǎn)品；一般檢測的是共轉(zhuǎn) 化的轉(zhuǎn)基因成分，而不是外源基因本身，因此，對于無標(biāo)記轉(zhuǎn)基因來說，采用現(xiàn)有的檢測方 法進(jìn)行檢測會失效;檢測基本上是定性檢測，但定量檢測又有其現(xiàn)實需求，例如，少量轉(zhuǎn)基 因馬鈴馨品種混入非轉(zhuǎn)基因品種中，在定性檢測時，非轉(zhuǎn)基因品種將被誤判為轉(zhuǎn)基因品種， 可能產(chǎn)生錯誤的法院判決或行政處罰。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)的問題，本發(fā)明實施例提供了一種馬鈴馨轉(zhuǎn)基因成分的檢測方 法。所述技術(shù)方案如下：
[0007] 本發(fā)明實施例提供了一種馬鈴馨轉(zhuǎn)基因成分的檢測方法，所述方法包括：
[000引確定待測樣品中需要檢測的轉(zhuǎn)基因成分、所述待測樣品中的內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因和所述 待測樣品的外源標(biāo)準(zhǔn)基因，所述待測樣品為馬鈴馨植株或馬鈴馨植株的一部分；
[0009] 制備用于擴增所述轉(zhuǎn)基因成分、所述內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因和所述外源標(biāo)準(zhǔn)基因的測試區(qū) 域的多重擴增引物；
[0010] 對所述待測樣品進(jìn)行抽樣并混合，得到混合樣品；
[0011] 提取所述混合樣品的基因組；
[0012] 向所述混合樣品的基因組中加入所述外源標(biāo)準(zhǔn)基因，得到混合核酸；
[0013] 利用所述多重擴增引物對所述混合核酸進(jìn)行擴增，得到擴增產(chǎn)物，利用所述擴增 產(chǎn)物構(gòu)建高通量測序文庫；
[0014] 對所述高通量測序文庫進(jìn)行高通量測序，得到測序片段組；
[0015] 分析所述測序片段組，獲得所述待測樣品中所述轉(zhuǎn)基因成分的測序片段的數(shù)量、 所述內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因的測序片段的數(shù)量和所述外源標(biāo)準(zhǔn)基因的測序片段的數(shù)量；
[0016] 根據(jù)所述外源標(biāo)準(zhǔn)基因的測序片段的數(shù)量，判斷實驗是否成功；
[0017] 若所述實驗成功，則計算所述待測樣品種中所述轉(zhuǎn)基因成分的含量；
[0018] 根據(jù)所述轉(zhuǎn)基因成分的含量判斷所述待測樣品中是否含有轉(zhuǎn)基因成分。
[0019] 具體地，所述轉(zhuǎn)基因成分為外源功能基因、抗性標(biāo)記基因、啟動子、終止子和外源 插入旁側(cè)序列中的至少一種。
[0020] 具體地，所述內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因為所述待測樣品的基因組中的單拷貝基因。
[0021 ]具體地，所述外源標(biāo)準(zhǔn)基因不存在于所有生物中。
[0022] 具體地，所述判斷實驗是否成功的方法為：當(dāng)所述外源標(biāo)準(zhǔn)基因的測序片段的數(shù) 量和所述內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因的測序片段的數(shù)量均含α1時，則實驗成功；當(dāng)所述外源標(biāo)準(zhǔn)基因的 測序片段的數(shù)量或所述內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因的測序片段的數(shù)量<α1時，則實驗失敗;其中，α1為判 定闊值。
[0023] 具體地，所述判定所述待測樣品是否含有轉(zhuǎn)基因成分的方法為：當(dāng)需要檢測的任 意一種所述轉(zhuǎn)基因成分的含量含02時，判定所述待測樣品含有轉(zhuǎn)基因成分；當(dāng)所有所述轉(zhuǎn) 基因成分的含量如2時，判定所述待測樣品不含有轉(zhuǎn)基因成分;其中，α2為判定闊值。
[0024] 具體地，計算所述待測樣品種中所述轉(zhuǎn)基因成分的含量的方法為:第m種所述轉(zhuǎn)基 因成分的含量的計算公式為
其中，i為所述第m種轉(zhuǎn)基因成分的 第i個測試區(qū)域，nl為所述第m種轉(zhuǎn)基因成分的所述測試區(qū)域的個數(shù)，bi為所述第m種轉(zhuǎn)基因 成分的第i個所述測試區(qū)域的所述測序片段的數(shù)量，k為第k種所述內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因，n3為所述 內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因的個數(shù)，j為第k種所述內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因的第j個測試區(qū)域，n2為所述第k種內(nèi)源 標(biāo)準(zhǔn)基因的所述測試區(qū)域的個數(shù)，aj為所述第k種內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因的第巧巾所述測試區(qū)域的所 述測序片段的數(shù)量;N為所有所述內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因的所述測試區(qū)域的總數(shù)。
[0025] 具體地，所述外源標(biāo)準(zhǔn)基因的質(zhì)量與所述混合樣品的基因組的總質(zhì)量的比例大于 1/100000。
[0026] 本發(fā)明實施例提供的技術(shù)方案帶來的有益效果是:本發(fā)明提供的檢測方法可W在 不同待測樣品、不同檢測的目標(biāo)基因間通用，可W-次性檢測任意多種需要檢測的轉(zhuǎn)基因 成分，從而判定待測樣品是否含有轉(zhuǎn)基因成分，該方法可W實現(xiàn)定量檢測，且檢測結(jié)果幾乎 沒有下限，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，是現(xiàn)有技術(shù)達(dá)不到的。
【具體實施方式】
[0027] 為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面將對本發(fā)明實施方式作進(jìn)一 步地詳細(xì)描述。本發(fā)明實施例中未注明或詳細(xì)描述的操作流程或操作規(guī)范均為普通分子生 物學(xué)技術(shù)人員所熟知的操作。本發(fā)明實施例中未注明的試劑或生物材料均為市場上銷售的 常用試劑或生物材料，均為普通分子生物學(xué)技術(shù)人員所熟知的，且可W在市場上購買到。 [002引實施例
[00巧]通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將雙丙氨酷憐抗性(Biolaphos resistance，Ba;r)基因?qū)胩?馨9號馬鈴馨品種，自交純化3代后，獲得改造的天馨9號馬鈴馨品種，作為本實施例的待測 馬鈴馨品種。其中，天馨9號馬鈴馨是轉(zhuǎn)基因馬鈴馨受體品種，由天水市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所中 梁試驗站育成，本實施例中使用的天馨9號馬鈴馨塊莖由江漢大學(xué)保存和繁殖。
[0030]馬鈴馨轉(zhuǎn)基因成分檢測方法，具體步驟如下：
[0031] 步驟1、確定待測樣品中需要檢測的轉(zhuǎn)基因成分、待測樣品中的內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因和待 測樣品的外源標(biāo)準(zhǔn)基因，具體方法如下:待測樣品為馬鈴馨植株或馬鈴馨植株的一部分，其 中，馬鈴馨植株可W為馬鈴馨植株的根、莖、葉、花、果實或種子等器官，也可W是巧巾及巧中 W上的不同器官的混合物，如葉和莖的混合物，馬鈴馨植株的一部分可W為馬鈴馨植株的 根、莖、葉、花、果實和種子等至少一個器官中的一部分。在本實施例中，待測樣品為改造后 的天馨9號馬鈴馨的葉片，轉(zhuǎn)基因成分、內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因和外源標(biāo)準(zhǔn)基因均含1個，轉(zhuǎn)基因成分 可W為外源功能基因、抗性標(biāo)記基因、啟動子、終止子和外源插入旁側(cè)序列中的至少一種， 即通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)手段向天馨9號馬鈴馨品種中轉(zhuǎn)入不存在于天馨9號馬鈴馨品種中的外 源核酸序列；內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因為待測樣品的基因組中的單拷貝基因。在本實施例中，內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn) 基因通過NCBKht化://www.ncbi .nlm.nih. gov/)在待測樣品基因組上比對時為單一序列； 外源標(biāo)準(zhǔn)基因不存在于所有生物中，在本實施例中，所使用的外源標(biāo)準(zhǔn)基因為邸CC04基因， 其在NCBI上同源比對時，未發(fā)現(xiàn)同源序列，可W判定外源標(biāo)準(zhǔn)基因不存在于所有生物中。在 本實施例中，檢測的轉(zhuǎn)基因成分共5種，內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因1種，外源標(biāo)準(zhǔn)基因1種，其相關(guān)信息見 表1，表1中所列轉(zhuǎn)基因成分不僅包括Bar基因，其為外源功能基因，還包括其他轉(zhuǎn)基因成分， 運些轉(zhuǎn)基因成分在轉(zhuǎn)基因作物中廣泛使用，因此，本實施例提供的檢測方法具有通用性。表 1中的基因序列有兩種表示方式，一種是直接寫出基因序列，另一種是NBCI的基因編號，表1 中的測序區(qū)域中的數(shù)字代表堿基的位置，該基因的第1個堿基的位置定義為1。
[0032] 表1為實施例一中被檢測基因的相關(guān)信息與檢測結(jié)果
[0033]
[0034]
[0035] 表1中'7'表示無。
[0036] 步驟2、制備用于擴增轉(zhuǎn)基因成分、內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因和外源標(biāo)準(zhǔn)基因的多重擴增引 物，具體方法如下：