多重PCR引物在線設(shè)計(jì)網(wǎng)頁(yè) https ://ampl iseq . com/，在"Application type''選項(xiàng)選擇"DNA Hotspot designs (single-pool)"。若選擇multi-poo 1，則多重PCR將分多管進(jìn)行，成本會(huì)有所增加，而 single-pool的引物只需要一次多重PCR即可，節(jié)省成本，所W本實(shí)施例選擇single-pool。 將表1中所列的每一個(gè)基因的序列用100個(gè)N連接起來，形成一個(gè)人工參考基因組，并在 "Select the genome you wish to use"選項(xiàng)中選擇乂ustom"后，上傳人工參考基因組。 DNA Type(類型)選項(xiàng)選擇"S化ndard DNA"(標(biāo)準(zhǔn)DNA)。在Add化tspot選項(xiàng)中，為表1中的每 一個(gè)基因隨機(jī)選擇1個(gè)通過NCBI同源比對(duì)獲得的同源序列的同源性均低于80%的測(cè)試區(qū) 域。其中，測(cè)試區(qū)域是指多重PCR的擴(kuò)增區(qū)域，也是高通量測(cè)序的區(qū)域，由于測(cè)試區(qū)域與其它 物種比較，無明顯的同源序列，因此，可W代表被檢測(cè)的基因，在高通量測(cè)序后，測(cè)試區(qū)域存 在測(cè)序片段，則表明被檢測(cè)的基因存在，測(cè)試區(qū)域的測(cè)序片段的數(shù)量，代表了被檢測(cè)基因的 量。此外，同源序列不包括轉(zhuǎn)基因成分的原始來源物種中的序列，例如，表1中的化ylAc基因 的原始來源物種為蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis，簡(jiǎn)稱化），因此，同源比對(duì)的 對(duì)像不包括蘇云金芽胞桿菌的基因組。為了保證本發(fā)明實(shí)施例的通用性，在NCBI上下載內(nèi) 源標(biāo)準(zhǔn)基因的種內(nèi)的不同序列，通過同源比對(duì)，獲得序列間的保守的區(qū)域，內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因的 測(cè)試區(qū)域選擇為在種內(nèi)邊界序列保守的區(qū)域。進(jìn)一步填寫獲得的每個(gè)測(cè)試區(qū)域的起始和終 止位置，最后點(diǎn)擊"Submit化rgets"按鈕提交，獲得擴(kuò)增表1中每一個(gè)基因的擴(kuò)增引物的序 列。多重?cái)U(kuò)增引物中每重引物的擴(kuò)增效率均在95%~105%之間，因此，需要驗(yàn)證多重?cái)U(kuò)增 引物的擴(kuò)增效率。具體驗(yàn)證方法為：由生工生物工程化海)股份有限公司合成表1中Bar基 因的序列和擴(kuò)增Bar基因的測(cè)試區(qū)域的擴(kuò)增引物序列，W合成的Bar基因的序列為模板，按 照美國(guó)賽默飛世爾公司的StepOne實(shí)時(shí)定量PCR儀的操作手冊(cè)（Part Number 4376784 Rev.E)檢測(cè)擴(kuò)增Bar基因的測(cè)試區(qū)域的擴(kuò)增引物的擴(kuò)增效率，若擴(kuò)增效率不在95%-105% 之間，則需要重新確定Bar基因的測(cè)試區(qū)域，設(shè)計(jì)并驗(yàn)證Bar基因的新的擴(kuò)增引物的效率，直 至其效率在95%-105%之間為止。按同樣的方法，驗(yàn)證表1中其它基因的擴(kuò)增引物的擴(kuò)增效 率。最終入選的擴(kuò)增引物的擴(kuò)增效率、序列W及對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增區(qū)域見表1，所有最終入選的擴(kuò) 增引物稱為多重?cái)U(kuò)增引物，多重?cái)U(kuò)增引物由美國(guó)賽默飛世爾公司合成并W混合液體的形式 提供給使用者。本實(shí)施例采用美國(guó)賽默飛世爾公司提供的多重PCR技術(shù)，其能夠同時(shí)擴(kuò)增多 至12000個(gè)測(cè)試區(qū)域，因此，本發(fā)明有能力一次性檢測(cè)現(xiàn)有的所有需要檢測(cè)的轉(zhuǎn)基因成分。
[0038] 步驟3、對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行抽樣并混合，得到混合樣品，具體方法如下：
[0039] 將待測(cè)樣品按照標(biāo)準(zhǔn)《轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測(cè)抽樣》(標(biāo)準(zhǔn)號(hào)：農(nóng)業(yè)部2031 號(hào)公告-19-2013)的散裝貨物的抽樣方法進(jìn)行抽樣，由于待測(cè)樣品僅有1種簡(jiǎn)單的來源，因 此，抽樣點(diǎn)改為1個(gè)，抽樣樣品的樣本量>1000粒種子，將所抽取的待測(cè)植物樣本充分混合， 得到混合樣品。
[0040] 步驟4、提取混合樣品的基因組，具體方法如下：
[0041 ] 參照標(biāo)準(zhǔn)《轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測(cè)DNA提取和純化》(標(biāo)準(zhǔn)號(hào):農(nóng)業(yè)部1485號(hào) 公告-4-2010)中的固態(tài)試樣的方法進(jìn)行預(yù)處理后提取混合樣品的基因組，提取出的為混合 樣品的基因組核酸。
[0042] 步驟5、向混合樣品的基因組中加入外源標(biāo)準(zhǔn)基因，得到混合核酸，具體方法如下：
[0043] 利用分光光度計(jì)(美國(guó)Quawe 11公司生產(chǎn)，型號(hào)為Q5000)中的雙鏈DNA程序，檢測(cè)獲 得的混合樣品的基因組的濃度。外源標(biāo)準(zhǔn)基因的質(zhì)量與混合樣品的基因組的總質(zhì)量的比例 大于1/100000,該比例用于保證在正常測(cè)序通量（含1M測(cè)序片段）下，高通量測(cè)序數(shù)據(jù)中可 W檢測(cè)到含10條外源標(biāo)準(zhǔn)基因，若高通量測(cè)序通量更低或更高，可W對(duì)該比例做相應(yīng)的調(diào) 整。本實(shí)施例中，混合樣品的基因組的總質(zhì)量為927ng，加入的外源標(biāo)準(zhǔn)基因?yàn)?.927ng，加 入比例為1 /1000，獲得混合核酸。
[0044] 步驟6、利用多重?cái)U(kuò)增引物對(duì)混合核酸進(jìn)行擴(kuò)增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物，利用擴(kuò)增產(chǎn)物構(gòu) 建高通量測(cè)序文庫(kù)，具體方法如下：
[0045] 利用文庫(kù)構(gòu)建試劑盒2.0(由美國(guó)LifeTechnology公司生產(chǎn)，貨號(hào)為4475345)構(gòu)建 高通量測(cè)序文庫(kù)。該文庫(kù)構(gòu)建試劑盒包括W下試劑：5XIon AmpliSeq?HiFi Mix、化化試 劑、轉(zhuǎn)換試劑、測(cè)序接頭溶液和DNA連接酶。文庫(kù)構(gòu)建的方法按該文庫(kù)構(gòu)建試劑盒的操作手 冊(cè)《Ion AmpliSeq?Libra;ry Pr邱arationK 出版號(hào)：MAN0006735,版本:A.O)進(jìn)行。多重PCR 的擴(kuò)增體系如下：5XIon AmpliSeq?HiFi Mix化1、制備的多重?cái)U(kuò)增引物的混合液體化1、 混合核酸lOng和無酶水11μ1。多重PCR的擴(kuò)增程序如下:99°C，2分鐘；（99°C，15秒;60°C，4分 鐘）X25個(gè)循環(huán)；10°C保溫。利用化化試劑消化掉多重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中多余的引物后，再進(jìn)行 憐酸化，具體方法為：向多重PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物中加入化1化化試劑，混勻后，在PCR儀上按如 下程序反應(yīng):50°C，10分鐘;55°C，10分鐘;60°C，10分鐘；10°C保存，得到混合物a，混合物a為 含有經(jīng)過憐酸化的擴(kuò)增產(chǎn)物的溶液。將憐酸化的擴(kuò)增產(chǎn)物連接上測(cè)序接頭，具體方法為：向 混合物a中加入轉(zhuǎn)換試劑化U則序接頭溶液化巧陽(yáng)NA連接酶化1，混勻后，在PCR儀上按如下 程序反應(yīng):22°C，30分鐘；72°C，10分鐘；10°C保存，得到混合液b。利用標(biāo)準(zhǔn)的乙醇沉淀方法 純化混合液b后溶解于10μ1無酶水中。利用美國(guó)Invi化igen公司生產(chǎn)的Qubi愧dsDNA HS Assay Kit(貨號(hào)為Q32852)并按照其說明書進(jìn)行檢測(cè)，獲得混合液b的質(zhì)量濃度后，將純化 后的混合液b稀釋至15ng/ml，得到濃度約l(K)pM的高通量測(cè)序文庫(kù)。
[0046] 步驟7、對(duì)高通量測(cè)序文庫(kù)進(jìn)行高通量測(cè)序，得到測(cè)序片段組，具體方法如下：
[0047] 利用獲得的高通量測(cè)序文庫(kù)和試劑盒Ion PI Template 0T2200Kit v2(美國(guó) invirtrigen公司生產(chǎn)，貨號(hào)為4485146)進(jìn)行測(cè)序前的ePCR化mulsion PCR,乳化聚合酶鏈 反應(yīng)）擴(kuò)增，操作方法按該試劑盒的操作手冊(cè)進(jìn)行。利用ePCR產(chǎn)物和試劑盒Ion PI Sequencing 200Kit v2(美國(guó) invi;rt;rigen 公司生產(chǎn)，貨號(hào)為4485149)在 Pro ton 二代高通量 測(cè)序儀上進(jìn)行高通量測(cè)序，操作方法按該試劑盒的操作手冊(cè)進(jìn)行。在本實(shí)施例中，高通量測(cè) 序量設(shè)置為1M測(cè)序片段（1M=100萬），測(cè)序長(zhǎng)度設(shè)置為500cycle(循環(huán)），測(cè)序結(jié)束后，獲得 測(cè)序片段組。
[0048] 步驟8、分析測(cè)序片段組，獲得待測(cè)樣品中轉(zhuǎn)基因成分的測(cè)序片段的數(shù)量、內(nèi)源標(biāo) 準(zhǔn)基因的測(cè)序片段的數(shù)量和外源標(biāo)準(zhǔn)基因的測(cè)序片段的數(shù)量，具體方法如下：
[0049] 根據(jù)測(cè)序片段的引物，利用61曰3*曰11(乂日'31〇112.2.26)軟件，按其默認(rèn)的參數(shù)設(shè) 置，將測(cè)序片段組比對(duì)到表1中各對(duì)應(yīng)檢測(cè)基因上，比對(duì)成功的測(cè)序片段即代表檢測(cè)到基 因，從而分別獲得待測(cè)樣品中各種轉(zhuǎn)基因成分的測(cè)序片段的數(shù)量、各種內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因的測(cè) 序片段的數(shù)量和外源標(biāo)準(zhǔn)基因的測(cè)序片段的數(shù)量，其結(jié)果見表1。
[0050] 步驟9、根據(jù)外源標(biāo)準(zhǔn)基因的測(cè)序片段的數(shù)量，判斷實(shí)驗(yàn)是否成功，具體方法如下：
[0051] 當(dāng)外源標(biāo)準(zhǔn)基因的測(cè)序片段的數(shù)量和內(nèi)源標(biāo)準(zhǔn)基因的測(cè)序片段的數(shù)量均含α1時(shí)， 則實(shí)驗(yàn)成功；當(dāng)外源標(biāo)準(zhǔn)基因的測(cè)序片