四種進(jìn)境奶牛攜帶病毒GeXP檢測(cè)方法的建立的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域，尤其是用于四種進(jìn)境奶牛病毒病的同時(shí)檢測(cè)與鑒 定。
【背景技術(shù)】
[0002] 口蹄疫（Foot and Mouth Disease，F(xiàn)MD)、牛病毒性腹瀉（Bovine Viral Diarrhea，BVD)、藍(lán)舌?。˙luetongue，BT)和赤羽?。ˋkabane Disease，AKA)是國(guó)家規(guī)定的 進(jìn)境奶牛需要隔離檢疫的4種病毒性疾病。近幾年，隨著國(guó)民對(duì)優(yōu)質(zhì)奶制品需求的提升，進(jìn) 境奶牛數(shù)量逐年攀升，給奶牛進(jìn)境口岸動(dòng)物疫病檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室?guī)硪欢ǖ墓ぷ鲏毫徒?jīng)費(fèi)負(fù) 擔(dān)。因此，建立一種可W同時(shí)鑒別診斷多種奶牛疫病的高通量快速檢測(cè)方法對(duì)減輕奶牛進(jìn) 境口岸檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室工作負(fù)擔(dān)、降低檢測(cè)經(jīng)費(fèi)及開展進(jìn)境奶牛攜帶疫病的流行病學(xué)調(diào)查具有 重要意義。
[0003] 目前，針對(duì)進(jìn)境奶牛的多種病毒性疾病，口岸動(dòng)物檢疫實(shí)驗(yàn)室普遍應(yīng)用病毒分離、 血清學(xué)方法和分子生物學(xué)方法進(jìn)行檢測(cè)。病毒分離培養(yǎng)是診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但存在測(cè)周期長(zhǎng)、 操作繁瑣等問題;病毒中和試驗(yàn)需要特異性的標(biāo)準(zhǔn)血清或病毒毒株，在實(shí)際應(yīng)用中具有一 定的局限性;進(jìn)口的酶聯(lián)免疫試劑盒普遍價(jià)格昂貴;普通PCR、巧光定量PCR等分子生物學(xué)方 法皆為針對(duì)單一病毒檢測(cè)，無法滿足多種病原混合感染鑒別診斷的檢測(cè)需求。多重PCR技術(shù) 已經(jīng)應(yīng)用于多種病原的鑒別診斷，但由于擴(kuò)增偏愛性問題無法實(shí)現(xiàn)真正意義上的高通量檢 測(cè)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 近幾年由于進(jìn)口奶牛數(shù)量的逐年增多，承擔(dān)進(jìn)境奶牛疫病檢測(cè)任務(wù)的動(dòng)物檢疫工 作人員亟需一種靈敏度高、特異性好的檢測(cè)方法W滿足降低外來動(dòng)物疫病傳入風(fēng)險(xiǎn)和實(shí)現(xiàn) 快速通關(guān)的工作需求。目前，大多口岸動(dòng)檢實(shí)驗(yàn)室所應(yīng)用的血清學(xué)(酶聯(lián)免疫法)實(shí)驗(yàn)，每種 檢測(cè)試劑盒只能檢驗(yàn)單一動(dòng)物疫病，無法鑒別多種動(dòng)物疫病的混合感染，并且進(jìn)口檢測(cè)試 劑盒昂貴的價(jià)格而給檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室?guī)砗艽蟮慕?jīng)濟(jì)壓力。因此，建立一種高通量、快速、特異 性好的檢測(cè)方法對(duì)于降低動(dòng)物疫病傳入風(fēng)險(xiǎn)，加速進(jìn)境動(dòng)物通關(guān)，促進(jìn)貿(mào)易便利化W及降 低動(dòng)物疫病檢測(cè)成本均有重要的意義。
[0005] GeXP多重基因表達(dá)分析系統(tǒng)將多重PCR技術(shù)和毛細(xì)管電泳技術(shù)結(jié)合起來，不僅具 有多重PCR擴(kuò)增高通量檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)，而且具有毛細(xì)管電泳靈敏性高的特點(diǎn)。GeXP的技術(shù)特點(diǎn) 是在特異性引物的5'端加入通用引物序列，組成特異性嵌合引物。在PCR反應(yīng)過程中，特異 性嵌合引物先分別與對(duì)應(yīng)的模板結(jié)合，保證后續(xù)擴(kuò)增的特異性，經(jīng)過多個(gè)循環(huán)W后，由通用 引物主導(dǎo)后續(xù)的擴(kuò)增，運(yùn)樣可W減少同一反應(yīng)體系中不同引物之間的干擾，實(shí)現(xiàn)每對(duì)引物 擴(kuò)增效率趨于一致，從而有效解決了常規(guī)多重PCR技術(shù)的擴(kuò)增偏愛性問題。
[0006] 本研究根據(jù)4種進(jìn)境奶牛檢疫性病毒的基因保守序列，分別設(shè)計(jì)了多對(duì)特異性引 物和通用引物，優(yōu)化反應(yīng)條件，通過對(duì)單一病毒模板、混合病毒模板的檢測(cè)驗(yàn)證了 GeXP多重 RT-PCR體系中每對(duì)引物擴(kuò)增的特異性和準(zhǔn)確性，建立了同時(shí)檢測(cè)4種奶牛病毒病的GeXP高 通量方法，檢測(cè)靈敏度至少可達(dá)1〇2拷貝/yL。該方法可為進(jìn)境奶牛病毒病的分子診斷及境 外奶牛疫病的流行病學(xué)調(diào)查提供技術(shù)支持。今后，還需要大量的陽性樣本或病毒毒株對(duì)本 方法做進(jìn)一步的驗(yàn)證和優(yōu)化。
【附圖說明】
[0007] 圖1-圖5GeXP多重RT-PCR特異性驗(yàn)證結(jié)果（圖1，AKAV;圖2，BVDV;圖3，BTV;圖4， FMDV;圖5,50bp-800bp Marker),圖中Y軸為相對(duì)巧光單位，表示擴(kuò)增產(chǎn)物的巧光強(qiáng)度，X軸 為毛細(xì)管電泳過程中擴(kuò)增產(chǎn)物的大小。
[000引圖6-圖1 IGeXP多重RT-PCR對(duì)4種病毒模板的靈敏度結(jié)果（圖6，106copiesAiL;圖7， l05copies/yL 圖8，l04copies/化；圖9，l03copies/iA;圖 10，l02copies/yL 圖 11，50bp- 800bp Marker)。
【具體實(shí)施方式】
[0009] GeXP啟動(dòng)試劑盒、DNA size standard Kit、分離緩沖液、上樣緩沖液購(gòu)自美國(guó)貝 克曼公司，一步法RT-PCR試劑盒、RNA提取試劑盒、基因純化試劑盒購(gòu)自德國(guó)QIAGEN公司，T7 體外轉(zhuǎn)錄試劑盒、Spe I限制性核酸內(nèi)切酶和RNA酶抑制劑均購(gòu)自大連寶生物公司，pGEX-T 載體購(gòu)自Promega公司。
[0010] 參考文獻(xiàn)選擇各病毒基因保守區(qū)并從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中下載4種病毒的基因序列， 通過DNASTAR軟件分析序列同源性，并用GeXP e卻ress Profiler工具設(shè)計(jì)多重特異性引 物。在正、反向特異性引物5'端分別連接一段非同源性序列作為通用引物(Tag),組成特異 性嵌合引物。引物由Invitrogen公司合成，HPLC純化。
[0011] SEQ ID 側(cè)：1-41(43:5'-466了64〔4圳4了4644了4〔4(：了60：1'刊4〔6圳0：41'(：-3'5'端用 cyS標(biāo)記；
[0012] 沈Q ID N0:2-AKA4:5'-GTACGACTCACTATAGGGACGGTGCATGTCGATAACCAG-3';
[0013] 沈Q ID NO: 3-BT3:5' -AGGTGACACTATAGAATAGTTCTCTAGTTGACCACC-3' 5'端用巧5標(biāo) 記；
[0014] SEQ ID N0:4-BT4:5'-GTACGACTCACTATAGGGAAAGCCAGACTGTTTCCCGAT-3';
[0015] 沈Q ID NO:5-BVDV3:5'-AGGTGACACTATAGAATAAGCGAAGGCCGAAAAGAGGCTA-3'5'端 用巧5標(biāo)記；
[0016] 沈Q ID N0:6-BVDV4:
[0017] 5'-GTACGACTCACTATAGGGAAACTCCATGTGCCATGTACAGCAG-3';
[001 引 SEQ ID N0:7-FMDV3:5'-AGGTGACACTATAGAATAGCCTGGTCTTTCCAGGTCT-3'5'端用 cyS標(biāo)記；
[0019] 沈Q ID N0:8-FMDV4:5'-GTACGACTCACTATAGGGACCAGTCCCCTTCTCAGATC-3';
[0020] SEQ ID 備:9-通用引物1:5'-466了64〔4(：了4了4644了4-3'5'端用〇巧標(biāo)記；
[00^] SEQIDN0:10-通用引物2:5'-GTACGACTCACTATAGGGA-3';
[0022] 滅活的BTV、AKAV、BVDV、FM