從白花丹中分離純化白花丹醌的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及從白花丹中分離純化白花丹醌的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 白花丹Plumbago zeylanica L.為藍(lán)雪科植物，在云南傣族、苗族、彝族等民間作 草藥使用，在印度、孟加拉國、斯里蘭卡、澳大利亞、非洲也廣泛使用，能治療風(fēng)濕痛，痛經(jīng)， 癰腫，潰瘍，四肢挫傷和消除腸道寄生蟲。白花丹醌是白花丹中的主要成分，在其根、莖、葉、 花、果實中都有分布，其中根中含量最高，約為0.4%，化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下 [1]:
[0003]
[0004] 近來研究發(fā)現(xiàn)，白花丹醌具抗癌、抗菌、抗炎、抗真菌和降血脂等作用[2]，具有良好 的開發(fā)應(yīng)用前景。但傳統(tǒng)的分離白花丹醌的柱層析等方法，需大量使用氯仿、甲醇、二氯甲 烷等有機溶劑，且耗時耗力 [3<。
[0005] 高速逆流色譜分離（High-speed counter-current chromatography,簡稱HSCCC) 技術(shù)是一種連續(xù)高效的液-液分配色譜分離技術(shù)，它不用任何固態(tài)的支撐物或載體，利用兩 相溶劑體系在高速旋轉(zhuǎn)的螺旋管內(nèi)建立起一種特殊的單向性流體動力學(xué)平衡，其中一相作 為固定相，另一相作為流動相，在連續(xù)洗脫的過程中能保留大量的固定相，物質(zhì)的分離依據(jù) 其在兩相中分配系數(shù)的不同而實現(xiàn)，特別適合于天然產(chǎn)物活性成分的分離 [8]。
[0006] 本發(fā)明擬通過HSCCC從白花丹中分離純化白花丹醌，以期為制備白花丹醌提供新 方法。目前還未見有人使用HSCCC技術(shù)對從白花丹中分離純化醌類物質(zhì)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一種利用HSCCC技術(shù)從白花丹中分離純化白花丹醌的方 法。
[0008] 高速逆流色譜是上世紀(jì)80年代才開始出現(xiàn)的一種新型的液-液分配色譜技術(shù)，其 中的各種參數(shù)種類和關(guān)系復(fù)雜，截止目前依然沒有充分的理論依據(jù)，換句話說，由于沒有規(guī) 律可循，在實際的操作過程中，研究者只能根據(jù)實踐經(jīng)驗來選擇各種參數(shù)并進行適當(dāng)?shù)慕M 合，如此以來，確定高速逆流色譜的適當(dāng)條件就變成了一項在海量的參數(shù)中進行隨機排列 組合的工作，不僅復(fù)雜而且艱巨，根本不可能通過簡單的篩選試驗來確定，更不可能根據(jù)其 他溶劑系統(tǒng)來推導(dǎo)[9~1()]。本發(fā)明在經(jīng)過大量的前期預(yù)試驗中，意外地發(fā)現(xiàn)，使用石油醚-乙 醇-水三元系統(tǒng)，能夠較好、較快地分離白花丹醌，并且能夠保持較高的固定相保留率，因此 擬定以此溶劑系統(tǒng)為基礎(chǔ)，采用HSCCC對白花丹中的白花丹醌進行分離純化。
[0009] 具體地，本發(fā)明提供了從白花丹中分離純化白花丹醌的方法，它包括如下操作步 驟：
[0010] (1)粗提物的制備：
[0011] 取白花丹藥材，以石油醚、乙醇、甲醇、乙酸乙酯、丙酮、乙醚、氯仿、二氯甲烷中的 一種或兩種以上的溶劑進行提取，合并提取液、過濾，濾液濃縮(可得稠膏）或除去溶劑(可 得干浸膏），得白花丹粗提物；
[0012] (2)采用高速逆流色譜法分離：
[0013] 取石油醚-(乙醇或甲醇)-水=5: (1~10): (1~10)，置于分液漏斗中配制兩相溶 劑系統(tǒng)，取上相作為固定相，下相為流動相;將固定相充滿色譜柱，在0-60°C下，主機正轉(zhuǎn)， 轉(zhuǎn)速為200-1000r/min，然后以l-20ml mL/min的流速栗入流動相，至兩相溶劑在柱中達(dá)到 平衡狀態(tài);步驟（1)制備的粗提物，以流動相為溶劑溶解，制備樣品溶液;將樣品溶液進樣， 在200~760nm下監(jiān)測，接收目標(biāo)成分，除去溶劑，干燥，即得白花丹醌。
[0014]白花丹藥材中，白花丹醌含量在白花丹根中最高，若綜合對資源的使用率和成本、 收益之間的平衡，優(yōu)選使用白花丹根進行提取。
[0015] 進一步地，步驟（1)中，提取溶劑選自乙醇。乙醇濃度可以為10~100% v/v;本發(fā)明 優(yōu)選為80~95 % v/v乙醇。本發(fā)明一個【具體實施方式】中，乙醇濃度優(yōu)選為95 % v/v。
[0016] 本發(fā)明提取方式可以是超聲、浸漬、回流、微波、超臨界流體或滲漉等，本發(fā)明一個
【具體實施方式】中采用的提取方式為超聲、浸漬或滲漉。
[0017]目前已知白花丹醌熔點低、易升華，一般在實際操作過程時都會盡量避免過熱處 理，基于上述本領(lǐng)域公知常識，本發(fā)明中所指的各提取方式和濃縮、干燥步驟的溫度控制均 應(yīng)盡量減少白花丹醌升華。
[0018] 進一步地，選取石油醚-乙醇-水=5: (5~7): (5~3)配制兩相溶劑系統(tǒng)，在該條件 下，白花丹醌都能夠有效分離。然而，基于對溶劑系統(tǒng)K值的考慮，當(dāng)K值越高分離時間越長， 保留時間越長，一般選擇K為0.5-2之間為宜，因此，本發(fā)明優(yōu)先選取5: (6~7): (4~3);進一 步優(yōu)先選取5:7:3。
[0019] 進一步地，步驟(2)中，轉(zhuǎn)速為800~1000r/min。本發(fā)明一個【具體實施方式】中，選取 的轉(zhuǎn)速為900r/min。
[0020]進一步地，步驟(2)中，栗入流動相的流速為1~3mL/min;本發(fā)明一個具體實施方 式中，選取的流速為2mL/min。
[0021] 進一步地，步驟(2)中，監(jiān)測波長為220~280nm。本發(fā)明一個【具體實施方式】中，選取 的波長為254nm〇
[0022] 在具體實施過程中，可將色譜溫度控制在室溫，以便節(jié)省能耗。
[0023]本發(fā)明中高速逆流色譜法使用該領(lǐng)域一般色譜柱即可，如容量300ml，內(nèi)徑0.5-2mm 〇
[0024]采用本發(fā)明H S C C C方法能在3小時內(nèi)實現(xiàn)從白花丹根粗提物中分離高純度 (98.0%)的白花丹醌，分離時間短，固定相保留率高達(dá)78%，樣品載樣量高，分離結(jié)果令人 滿意。并且有機溶劑使用量小，對環(huán)境的污染小，對操作人員的健康影響也小，本研究為大 規(guī)模制備白花丹醌這一極具開發(fā)價值的民族藥主要成分提供了新方法，對使用HSCCC法分 離類似物質(zhì)也具有參考價值。
[0025] 顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識和手段，在不脫離本發(fā) 明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其他多種形式的修改、替換或變更。
[0026] 以下通過具體實施例的形式，對本發(fā)明的上述內(nèi)容再做進一步的詳細(xì)說明。但不 應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實施例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實現(xiàn) 的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
【附圖說明】
[0027]圖1高速逆流色譜圖
[0028]圖2白花丹粗提物的高效液相圖譜
[0029]圖3本發(fā)明制備的白花丹醌高效液相圖譜
【具體實施方式】
[0030] 儀器與試藥
[0031] TBE-300A高速逆流色譜儀（上海同田生物技術(shù)有限公司）；Waters 2695高效液相 色譜儀;Waters 2996型二極管陣列檢測器;Empower色譜工作站）。
[0032] 白花丹藥材(成都荷花池中藥材市場）；甲醇為色譜純;水為娃哈哈純凈水;其余試 劑均為分析純。
[0033]實施例1本發(fā)明提取分離方法
[0034] (1)粗提物的制備取65g白花丹根藥材(過三號篩），加400mL無水乙醇，浸泡過夜， 超聲提取30分鐘。同法提取兩次。合并提取液、過濾，濾液低壓旋轉(zhuǎn)濃縮，得8.9g白花丹粗提 物。
[0035] (2)HSCCC 分離純化
[0036] A、室溫下按石油醚-乙醇-水=5:7:3比例配制溶液適量，置分液漏斗中震蕩，靜置 分層。上相為固定相，下相為流動相。
[0037] B、取700mg白花丹粗提物浸膏加流動相15mL，使樣品充分溶解。
[0038] C、將色譜柱(色譜柱容量300ml，內(nèi)徑0.5-2mm)由首端向尾端充滿固定相（上相）， 主機正轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)速為900r/min，然后以2mL/min的流速栗入流動相（下相），待流動相流出兩相 溶劑在色譜柱中達(dá)到平衡狀態(tài)時，通過進樣閥注入樣品，用紫外檢測器在波長254nm進行檢 測，同時用記錄儀記錄色譜圖，如圖2所示，收集目標(biāo)成分的流出液。主峰A(140-180min)減 壓回收溶劑，真空干燥，每700mg白花丹粗提物中可得8mg橙紅色針狀結(jié)晶。
[0039] 產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)鑒定取分離所得橙紅色針晶，進行碳譜和氫譜測定。結(jié)果與文獻(xiàn)報道 的白花丹醌一致[1142]。
[0040] 純度分析將粗提物、橙紅色針狀結(jié)晶分別用甲醇溶解，采用如下色譜條件進行 HPLC分析，結(jié)果見圖2、3:
[0041 ] Dikma Diamonsil Cis柱（250mmX4.6mm，5ym;流動相為甲醇-水(75:25);檢測波長 254nm;流速lmL/min;柱溫30 °C ;進樣量 10yL。
[0042] 由結(jié)果可知，本發(fā)明分離純化得到的白花丹醌純度為98.0% (面積歸一化法）。
[0043] 除了實施例1中的溶劑系統(tǒng)外，發(fā)明人在試驗中還進行了相似溶劑系統(tǒng)的比對，見 表1:
[0044] 表 1
[0045]
[0046] 本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)石油醚-乙醇-水(5:6:4)、石油醚-乙醇-水(5:5:5)時，也能將 白花丹醌分開，但是，K值越高分離時間越長，保留時間越長，一般選擇K為0.5-2之間為宜， 本發(fā)明中更優(yōu)選實施例1的配比，其分離效率最高。
[0047] 試驗結(jié)果表明，采用本發(fā)明HSCCC方法能在3小時內(nèi)實現(xiàn)從白花丹根粗提物中分離 高純度的白花丹醌，分離時間短，固定相保留率高達(dá)78%，樣品載樣量高，分離結(jié)