一種生物法制備高純度葉黃素晶體的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明公開(kāi)了一種生物法制備高純度葉黃素晶體的方法，屬于葉黃素領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]葉黃素屬于“類胡蘿卜素”類物質(zhì)，它是構(gòu)成玉米、蔬菜、水果、花卉等植物色素的重要組分。洋甘藍(lán)、羽衣甘藍(lán)、菠菜等深綠色葉菜以及金盞花等花卉中即含大量的葉黃素。葉黃素是一種含氧的類胡蘿卜素，具有多種功能。具有抗氧化、抑制活性氧自由基、抗癌、增強(qiáng)免疫力、降低心血管病的發(fā)病率，尤其在預(yù)防和治療老年性白內(nèi)障和老年黃斑變性方面效果顯著。葉黃素因其分子結(jié)構(gòu)的不對(duì)稱，在合成工藝上比較復(fù)雜，化學(xué)合成葉黃素的瓶頸尚未攻克，葉黃素的獲取仍舊依賴天然植物的供給。另外天然微生物的發(fā)酵代謝產(chǎn)物也在不斷為葉黃素的來(lái)源擴(kuò)大思路，通過(guò)細(xì)菌菌株或藻類藻株來(lái)篩選葉黃素的微生物，進(jìn)一步提取葉黃素，利用分離純化技術(shù)制成葉黃素成品
目前葉黃素生產(chǎn)工藝為將金盞菊中葉黃素酯提取并在堿性條件下皂化生成葉黃素，此時(shí)葉黃素極易分解，產(chǎn)品收率非常低，溶劑殘留嚴(yán)重，整個(gè)生產(chǎn)工藝復(fù)雜，試劑量大，成本難以控制。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明主要解決的技術(shù)問(wèn)題:針對(duì)目前葉黃素生產(chǎn)工藝為將金盞菊中葉黃素酯提取并在堿性條件下皂化生成葉黃素，此時(shí)葉黃素極易分解，產(chǎn)品收率非常低，溶劑殘留嚴(yán)重，整個(gè)生產(chǎn)工藝復(fù)雜，試劑量大，成本難以控制的問(wèn)題，提供了一種生物法制備高純度葉黃素晶體的方法，本發(fā)明從萬(wàn)壽菊中提取得到葉黃素粗品，再用生物發(fā)酵法對(duì)其進(jìn)行提純，得到高純度葉黃素晶體，本發(fā)明采用的生物法選擇性高，催化效果好，而且條件溫和，工藝簡(jiǎn)單，制備過(guò)程中產(chǎn)生的溶劑殘留量小，對(duì)環(huán)境污染小，制備得到的產(chǎn)品的純度高，成本低，具有廣泛的應(yīng)用前景。
[0004]為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是:
(1)稱取100?200g干燥粉碎后的萬(wàn)壽菊粉末，按固液比1:20與石油醚混合，
并在300?400W功率和30?35 °C下進(jìn)行超聲提取25?30min，提取后過(guò)濾，并將濾液真空濃縮回收石油醚溶劑，得到葉黃素酯浸膏；
(2)將上述葉黃素酯浸膏按固液比1:10溶解在石油醚中，并加入總體積30?
50%濃度為lmol/L的氫氧化鈉溶液進(jìn)行皂化反應(yīng)I?2h，反應(yīng)完成后抽濾，將濾液用質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%鹽酸調(diào)節(jié)pH值為7.0，將調(diào)節(jié)后的濾液在45?55°C下蒸餾2?3h，蒸餾完成后冷卻至室溫，并放入O?5°C的冰水中靜置20?30min，靜置后快速抽濾，得到葉黃素粗品；
(3)分別選取3?5g磷酸氫二鉀，3?5g磷酸二氫鉀，2?4g硫酸鎂，0.3?0.5g
氯化鈉和0.3?0.5h二水氯化鈣加入到250mL的容量瓶中，加入去離子水定容到刻度線，搖晃均勻，得培養(yǎng)液；
(4 )從上述容量瓶中取出150?170mL培養(yǎng)液，并用質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%硝酸調(diào)節(jié)其 pH值為7.0，將調(diào)節(jié)后的溶液和8?1g牛肉膏、5?7g蛋白胨和4.5?5.5g步驟(2)葉黃素粗品混合，得固體培養(yǎng)基，混合后均勻?qū)⑵滗伷桨迳希?br> (5)在上述鋪平板中，分別接種5?10株黑曲霉菌、8?12株糙皮側(cè)耳菌和3?
5株青霉菌，在25?30 0C下?lián)u床發(fā)酵64?70h，發(fā)酵結(jié)束后離心分離，得上清液，將得到后的上清液在50?60°C下減壓蒸餾I?2h，蒸餾完成后冷卻至室溫，并放入O?5°C的冰水中靜置20?30min，靜置后快速抽濾，得到高純度葉黃素晶體，并置于60°C的烘箱中干燥10?12h，干燥后收集即可。
[0005]本發(fā)明的應(yīng)用的方法:本發(fā)明制得的高純度葉黃素晶體可以廣泛應(yīng)用于保健品和藥物中，具有抗氧化、抑制活性氧自由基、抗癌、增強(qiáng)免疫力、降低心血管病的發(fā)病率，尤其在預(yù)防和治療老年性白內(nèi)障和老年黃斑變性方面效果顯著。
[0006]本發(fā)明的有益效果是:
(1)本發(fā)明采用的生物法選擇性高，催化效果好，而且條件溫和，工藝簡(jiǎn)單；
(2)本發(fā)明制備過(guò)程中產(chǎn)生的溶劑殘留量小，對(duì)環(huán)境污染小，制備得到的產(chǎn)品的純度高，成本低。
【具體實(shí)施方式】
[0007]首先稱取100?200g干燥粉碎后的萬(wàn)壽菊粉末，按固液比1:20與石油醚混合，
并在300?400W功率和30?35 °C下進(jìn)行超聲提取25?30min，提取后過(guò)濾，并將濾液真空濃縮回收石油醚溶劑，得到葉黃素酯浸膏；將葉黃素酯浸膏按固液比1:10溶解在石油醚中，并加入總體積30?50%濃度為lmol/L的氫氧化鈉溶液進(jìn)行皂化反應(yīng)I?2h，反應(yīng)完成后抽濾，將濾液用質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%鹽酸調(diào)節(jié)pH值為7.0，將調(diào)節(jié)后的濾液在45?55°C下蒸餾2?3h，蒸餾完成后冷卻至室溫，并放入O?5°C的冰水中靜置20?30min，靜置后快速抽濾，得到葉黃素粗品；分別選取3?5g磷酸氫二鉀，3?5g磷酸二氫鉀，2?4g硫酸鎂，0.3?0.5g氯化鈉和0.3?0.5h二水氯化鈣加入到250mL的容量瓶中，加入去離子水定容到刻度線，搖晃均勻，得培養(yǎng)液;從容量瓶中取出150?170mL培養(yǎng)液，并用質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%硝酸調(diào)節(jié)其pH值為7.0，將調(diào)節(jié)后的溶液和8?1g牛肉膏、5?7g蛋白胨和4.5?5.5g葉黃素粗品混合，得固體培養(yǎng)基，混合后均勻?qū)⑵滗伷桨迳?在鋪平板中，分別接種5?10株黑曲霉菌、8?12株糙皮側(cè)耳菌和3?5株青霉菌，在25?30 0C下?lián)u床發(fā)酵64?70h，發(fā)酵結(jié)束后離心分離，得上清液，將得到后的上清液在50?60 °C下減壓蒸餾I?2h，蒸餾完成后冷卻至室溫，并放入O?5°C的冰水中靜置20?30min，靜置后快速抽濾，得到高純度葉黃素晶體，并置于60°C的烘箱中干燥10?12h，干燥后收集即可。
[0008]實(shí)例I
首先稱取10g干燥粉碎后的萬(wàn)壽菊粉末，按固液比1:20與石油醚混合，并在300W功率和30°C下進(jìn)行超聲提取25min，提取后過(guò)濾，并將濾液真空濃縮回收石油醚溶劑，得到葉黃素酯浸膏;將葉黃素酯浸膏按固液比1:10溶解在石油醚中，并加入總體積30%濃度為lmol/L的氫氧化鈉溶液進(jìn)行皂化反應(yīng)Ih，反應(yīng)完成后抽濾，將濾液用質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%鹽酸調(diào)節(jié)pH值為7.0，將調(diào)節(jié)后的濾液在45°C下蒸餾2h，蒸餾完成后冷卻至室溫，并放入(TC的冰水中靜置20min，靜置后快速抽濾，得到葉黃素粗品；分別選取3g磷酸氫二鉀，3g磷酸二氫鉀，2g硫酸鎂，0.3g氯化鈉和0.3h二水氯化鈣加入到250mL的容量瓶中，加入去離子水定容到刻度線，搖晃均勻，得培養(yǎng)液；從容量瓶