br>[0038] 甲醇、乙腈:美國Fluka公司；
[0039]乙醇：國藥集團；
[0040]二氯甲烷:國藥集團；
[0041 ] 二甲基亞砜(DMS0):國藥集團；
[0042]超聲波清洗器，AS系列，天津奧特賽恩斯儀器有限公司；
[0043]旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，R-205B，上海申勝儀器公司；
[0044] D-101大孔樹脂:天津富邦化工科技有限公司；
[0045]柱色譜硅膠:青島海洋化工廠生產(chǎn)；
[0046]薄層色譜硅膠板:青島海洋化工廠生產(chǎn)；
[0047] ZFB型三用紫外分析儀:上?？等A生化儀器制造有限公司；
[0048] 恒溫水浴鍋:北京醫(yī)療電子儀器廠；
[0049] 超聲波清洗器(JK-500B):合肥金尼克機械制造有限公司；
[0050] 氮吹儀:北京優(yōu)晟聯(lián)合科技有限公司；
[0051 ]分析用液相色譜:依利特高效液相色譜，配UV1201檢測器；
[0052] 分析色譜柱:Unitary C18 4.6mmX250mm，5ym，浙江華譜新創(chuàng)科技有限公司；
[0053] 制備色譜柱:(：18，10臟\250臟，5以111，浙江華譜新創(chuàng)科技有限公司；
[0054] 半制備液相色譜:創(chuàng)新通恒的LC3000型；
[0055] DAC制備色譜:創(chuàng)新通恒公司LC6000高效液相色譜；
[0056] 2)具體提取方法:將自然陰干的油茶干燥葉粉碎成60目以上的粉末，取20kg分兩 批用50 %乙醇按料液比1: 3加熱回流重復提取2次，每次提取2h，加熱提取的溫度控制在70 °C，合并所得上清液，過濾獲得上清液，減壓濃縮至無醇味，得到原體積一半的粗提液樣品， 備用；
[0057] 3)油茶50%醇提取物樣品經(jīng)過質(zhì)譜分析，鑒定18個組分，其中的花青素，以及提取 液中的大量的多糖、蛋白質(zhì)，鞣質(zhì)等親水性成分，復雜且難于分離，都不作為本發(fā)明研究的 重點。因此需用D101型大孔吸附樹脂純化，方法是：用工業(yè)酒精處理約10L的D101型大孔吸 附樹脂，用水洗到無醇味，取一半提取液分兩次上樣，依次用水、20%乙醇、80%乙醇洗脫， 每個梯度洗脫4倍柱體積，根據(jù)TLC和HPLC分析結(jié)果，各部位合并濃縮，其中80 %乙醇部位總 樣-硅膠柱層析合并組分色譜圖如圖1所示，對D101大孔樹脂洗脫得到的三個部位進行分析 顯示，水洗部位含有大量多糖和蛋白質(zhì)等，20%乙醇部位可能含有茶皂苷等中等極性化合 物，但這一部位有大量有色物質(zhì)干擾，而且樣品的紫外吸收較弱，分離難度也較大。80 %乙 醇部位活性較強，富含目標化合物，因此作為重點分離的目標。其中，流動相A為甲醇，B為 水;洗脫程序：〇-l〇min 50 % A，10-20min80 % A，20-2 lmin 100 % A;檢測波長 254nm，進樣量 10yL；
[0058] 4)將采用80%乙醇洗脫得到洗脫液樣品濃縮干燥(約150g)，溶解于一定比例的二 氯甲烷-甲醇中，拌入300g薄層層析硅膠(200-300目），水浴揮干，分兩次裝柱，其中每次空 白層裝填硅膠約800g，流動相為二氯甲烷-甲醇（10:1-1:3梯度洗脫），每500mL收集為一個 流份，經(jīng)過TLC檢測合并為 1-2+2'，3-7+3'-7'，8-10+8'-10'，11-13+11'，14-16+12'-13'， 17-19+14'，20-22+15'-18'，19'-21'，23-26+22'-27'，27-40,28'-34'，35'-44'，41-47,48-64,65,66-67,68-70,71，72-78,45'-51'，52'-63'，64'-67'，68'-71'，72'-84'共計24個組 分(兩次硅膠柱的流份用序號后面的符號加以區(qū)分，部分流份進行交叉合并，用加號銜接）；
[0059] 5)經(jīng)過液相檢測，選取其中的第2個單位的洗脫液3-7+3 ' -7 '進行細分，溶解于一 定比例的二氯甲烷-甲醇中，拌入8g薄層層析硅膠(200-300目），水浴揮干，空白層裝填硅膠 約80g。流動相系統(tǒng)為二氯甲烷-甲醇(50:1-10:1梯度洗脫），每100mL收集為一個流份，經(jīng)過 TLC 檢測合并為 1，2-3，4,5-7,8,9-10,11，12-14,15,16-17,18-21，22-24,25-26,27-30，31， 32-36共計16個流份，12-14利用DAC制備色譜分離(色譜圖如圖2所示），60wt %甲醇-水梯度 洗脫，得到兩個單體化合物C0-6，C0-7，以及兩個需進一步純化的組分，再利用半制備液相 色譜對這兩個組分進行制備，40 %乙腈-水恒定洗脫，得到兩個單體化合物⑶-12，⑶-13， C0-13即為目標化合物。
[0060] 下面對得到的目標化合物進行結(jié)構(gòu)鑒定，所用的儀器與試劑:NMR:核磁共振所有Η 譜全為400MHz，所有13C譜均為100MHz。核磁共振檢測條件:核磁共振一維和二維脈沖序列采 用儀器的相應標準程序，1H-NMR譜采樣脈沖寬度90°，累加次數(shù)32; 13C-NMR譜采樣脈沖寬度 90°，累加次數(shù)，2000，H-H C0SY、HSQC、HMBC三種試驗采樣數(shù)據(jù)陣均為F2 XFfSCMS X 256，零 填充至2048 X 1024進行FT變換，窗函數(shù)處理譜圖。
[0061] 具體鑒定過程按照如下操作進行：
[0062] 化合物C0-13,白色無定形粉末，如圖3中HRESMS(Positive)顯示:m/z 377.1398 [M+H] + (Calcd for C23H2i〇5,377.1389)，753.2779[2M+H] +，283.0956[M+H-C6Hi20] +，結(jié)合1Η-NMR及13C-NMR確定化合物CO-13的分子式為C 23H2〇05。
[0063] 匪R圖譜如圖4所示，從譜圖中可以看出，在低場區(qū)可以清晰的觀察到6組芳基 質(zhì)子信號，包括一對處于苯基間位的兩質(zhì)子信號S6.49(lH，d，J = 2.3Hz)，6.40(lH，d，J = 2.3他）和四組對稱質(zhì)子信號56.80(2!1，(1，了 = 8.5抱），6.78(2!1，(1，了 = 8.5抱），6.67(2!1，(1，了 = 8.5HZ)，6.62(2H，d，J = 8.5Hz)，根據(jù)偶合常數(shù)判斷四組對稱質(zhì)子信號均為苯基鄰位偶 合;S4.14(lH，br d，J = 6.6Hz)為位于吸電基團去屏蔽區(qū)的質(zhì)子信號；在高場區(qū)存在δ2.83 (lH，dd，J = 6.6，15.5Hz)，2.72(lH，br (1，了=15.5抱），2.63(2!1，111)和2.52(2!1，111)四組信號， 分屬于三組亞甲基。
[0064]結(jié)合所有核磁譜圖及分析，化合物⑶-13鑒定為4-對羥基苯基-5-對羥基苯乙基-7-羥基-3，4-二氫香豆素。查Scifinder數(shù)據(jù)庫，該化合物為新物質(zhì)，分子量為376，提取純度 可達95wt %以上，化學結(jié)構(gòu)式為：
[0065]
[0066] 實施例2
[0067] 香豆素類化合物的提取方法如下步驟操作：
[0068] 1)所用的試驗儀器與試劑準備與實施例1基本相同；
[0069] 2)具體提取方法:將自然陰干的油茶干燥葉粉碎成70目以上的粉末，取20kg分兩 批用60 %乙醇按料液比1: 3加熱回流重復提取2次，每次提取2h，加熱提取的溫度控制在80 °C，合并所得上清液，過濾獲得上清液，減壓濃縮至無醇味，得到原體積一半的粗提液樣品， 備用；
[0070] 3)油茶50%醇提取物樣品經(jīng)過質(zhì)譜分析，鑒定18個組分，其中的花青素，以及提取 液中的大量的多糖、蛋白質(zhì)，鞣質(zhì)等親水性成分，復雜且難于分離，都不作為本發(fā)明研究的 重點。因此需用D101型大孔吸附樹脂純化，方法是：用工業(yè)酒精處理約10L的D101型大孔吸 附樹脂，用水洗到無醇味，取一半提取液分兩次上樣，依次用水、30%乙醇、75%乙醇洗脫， 每個梯度洗脫4倍柱體積，根據(jù)TLC和HPLC分析結(jié)果，各部位合并濃縮；
[0071] 4)將采用75%乙醇洗脫得到洗脫液樣品濃縮干燥(約150g)，溶解于一定比例的二 氯甲烷-甲醇中，拌入300g薄層層析硅膠(200-300目），水浴揮干，分兩次裝柱，其中每次空 白層裝填硅膠約800g，流動相為二氯甲烷-甲醇（10:1-1:3梯度洗脫），每400mL收集為一個 流份，經(jīng)過TLC檢測合并為 1-2+2'，3-7+3'-7'，8-10+8'-10'，11-13+11'，14-16+12'-13'， 17-19+14'，20-22+15'-18'，19'-21'，23-26+22'-27'，27-40,28'-34'，35'-44'，41-47,48-64,65,66-67,68-70,71，72-78,45'-51'，52'-63'，64'-67'，68'-71'，72'-84'共計24個組 分(兩次硅膠柱的流份用序號后面的符號加以區(qū)分，部分流份進行交叉合并，用加號銜接）；
[0072] 5)經(jīng)過液相檢測，選取其中的第2個單位的洗脫液3-7+3 ' -7 '進行細分，溶解于一 定比例的二氯甲烷-甲醇中，拌入8g薄層層析硅膠(200-300目），水浴揮干，空白層裝填硅膠 約80g。流動相系統(tǒng)為二氯甲烷-甲醇(50:1-10:1梯度洗脫），每90mL收集為一個流份，經(jīng)過 TLC 檢測合并為 1，2-3，4,5-7,8,9-10,11，12-14,15,16-17,18-21，22-24,25-26,27-30，31， 32-36共計16個流份，12-14利用DAC制備色