. 01)，此劑量與環(huán)磷酰胺組比 較無(wú)明顯差異。
[0148] 在凈體重變化方面，除空白與模型組表現(xiàn)為體重上升，其余各組均出現(xiàn)體重下降 的現(xiàn)象，各組別與模型組及空白組比較均表現(xiàn)出極顯著差異（P〈〇. 01)。
[0149] 在胸腺指數(shù)方面，各實(shí)驗(yàn)組別胸腺指數(shù)均下降，且與空白組比較均表現(xiàn)出極顯著 差異（P〈0. 01)，與模型組比較低劑量組表現(xiàn)出顯著差異（P〈0. 05)。
[0150] 在脾指數(shù)方面，各實(shí)驗(yàn)組別脾指數(shù)均明顯上升，且與空白組比較均表現(xiàn)出極顯著 差異（P〈0. 01)，黃綠蜜環(huán)菌各給藥組別與模型組比較有顯著差異（P〈0. 05)。
[0151] 在給藥治療期間，各組小鼠體重均在一定范圍內(nèi)波動(dòng)上升并無(wú)明顯差別。
[0152] 在給藥治療期間，除空白組飲食量維持恒定水平，各組小鼠飲食量均表現(xiàn)飲食量 下降的趨勢(shì)。
[0153] 綜上所述，推測(cè)本發(fā)明實(shí)施例1所得大豆素提取物在給藥劑量為73. 71mg/kg、月艮 藥劑量為10天時(shí)，其對(duì)小鼠 Lewis肺癌模型具有一定的療效，腫瘤抑制率為30. 19%。通過(guò) 小鼠胸腺指數(shù)及脾指數(shù)的比較，我們發(fā)現(xiàn)Lewis肺癌小鼠模型本身會(huì)降低胸腺指數(shù)，升高 脾指數(shù)，本實(shí)驗(yàn)中大豆素提取物對(duì)肺癌模型小鼠的胸腺作用并不明顯，但促進(jìn)了模型小鼠 的脾腫大現(xiàn)象。但整體來(lái)看，大豆素對(duì)小鼠的肺癌細(xì)胞有一定的殺傷力，從而抑制腫瘤細(xì)胞 的過(guò)快增長(zhǎng)。
[0154] 實(shí)施例8 :大豆素單體化合物抗H22腫瘤試驗(yàn)
[0155] 主要材料與試劑：
[0156] H22肝癌瘤株（第2代）由天津國(guó)際生物醫(yī)藥聯(lián)合研究院家蠶生物反應(yīng)器平臺(tái) 贈(zèng)與；環(huán)磷酰胺片（20130101)購(gòu)自天津金世制藥有限公司；吐溫80由北京博潤(rùn)萊特科 技有限公司分裝；KM小鼠（16~22g)(動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(京）2014-0013,合格證號(hào)： 11400500007663)購(gòu)自天津市奧臣實(shí)驗(yàn)動(dòng)物銷售有限公司。
[0157] 本實(shí)施例擬在采用H22肝癌小鼠模型考察大豆素單體化合物抗肝癌腫瘤作用。具 體步驟如下：
[0158] 1.小鼠 H22肝癌荷瘤模型建立
[0159] 取接種腫瘤8-13天狀態(tài)良好的荷瘤脫白處死，體表酒精消毒，在無(wú)菌（超凈臺(tái)） 環(huán)境下剝離小鼠腫瘤至盛有生理鹽水的無(wú)菌平皿，剪至小塊，將小塊腫瘤放入組織勻漿器， 按體積比1:3左右加入生理鹽水勻漿，勻漿液倒入50ml無(wú)菌離心管，備用。用lml注射器在 KM小鼠右腋下注射接種0. 2ml，腫瘤細(xì)胞混懸液的制備均在無(wú)菌條件下（超凈工作臺(tái)中） 完成。從取出腫瘤至腫瘤接種完畢在60分鐘內(nèi)完成。
[0160] 2.藥物制備方法
[0161] 大豆素提取物（實(shí)施例1所得）灌胃劑：稱定一定重量的大豆素提取物樣品至研 缽中，加入所需溶劑體積2 %吐溫-80,研磨混合后再加入所需體積的生理鹽水，混勻后，備 用。
[0162] 環(huán)磷酰胺灌胃劑：去掉環(huán)磷酰胺片的薄膜衣后進(jìn)行稱取，稱取一定重量至研缽中， 加入所需體積的生理鹽水，充分研磨、混勻后備用。
[0163] 3.分組及給藥方法
[0164] 將60只實(shí)驗(yàn)小鼠共分為6組，每組10只，雌雄各半，分為①低劑量（7. 06mg/kg) 組、②中劑量（23. 14mg/kg)組、③高劑量（71.07mg/kg)組、④環(huán)磷酰胺組、⑤模型組、⑥ 空白組，以上除空白組及模型組外，其余各組在注射腫瘤混懸液后，均每日給藥一次，每次 0. lml/10g，連續(xù)給藥10天，空白組及模型組在相同給藥時(shí)間及給藥時(shí)長(zhǎng)灌胃給予2 %吐 溫-80水溶液，連續(xù)灌胃10天。
[0165] 4.觀察指標(biāo)
[0166] 4. 1大體狀態(tài)
[0167] 每日對(duì)小鼠進(jìn)行體重、飲食量的稱定并記錄，于最后一次計(jì)算小鼠除瘤后的體重 凈重。
[0168] 4. 2瘤重及腫瘤抑制率
[0169] 每日對(duì)小鼠右腋下進(jìn)行觀察，于最后一次給藥24h后，解剖并取出腫瘤組織，稱取 腫瘤重量，按下述公式計(jì)算腫瘤生長(zhǎng)抑制率。
[0170]
[0171] 4. 3胸腺重量及胸腺指數(shù)
[0172] 于最后一次給藥24h后，解剖小鼠并取出胸腺組織，稱量胸腺重量，按下述公式計(jì) 算胸腺比。
[0173]
[0174] 4.4脾臟重量及脾指數(shù)
[0175] 于最后一次給藥24h后，解剖小鼠并取出脾臟，稱量脾臟重量，按下述公式計(jì)算脾 指數(shù)。
[0176]
[0177] 5.數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)
[0178] 各組別小鼠相應(yīng)數(shù)據(jù)均以表示，采用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，各組別采用one-way AN0VA檢驗(yàn)。各實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如表2、圖20-25所示。
[0179] 表2大豆素提取物抗肝癌腫瘤試驗(yàn)結(jié)果土$ )
[0180]
[0182] 注：與模型組比較*噸〈0.01、郵〈0.05;與空白組比較\'〈0.01、、〈0.05。
[0183] 由以上數(shù)據(jù)可知，實(shí)施例1所得以大豆素提取物在給予劑量為71. 07mg/kg，服藥 天數(shù)為10天時(shí)與H22肝癌腫瘤模型小鼠比較有顯著差異（P〈0. 05)，此劑量與環(huán)磷酰胺組比 較無(wú)明顯差異。
[0184] 在凈體重變化方面，各組別均表現(xiàn)為體重上升，且各組別之間比較并無(wú)顯著差異。
[0185] 在胸腺指數(shù)方面，各實(shí)驗(yàn)組別胸腺指數(shù)均下降，大豆素低劑量組與空白組比較表 現(xiàn)出顯著差異（P〈〇. 05)，環(huán)磷酰胺組、模型組與空白組比較表現(xiàn)出極顯著差異（P〈0. 01)。
[0186] 在脾指數(shù)方面，各實(shí)驗(yàn)組別脾指數(shù)均明顯上升，除大豆素高劑量組外，其余實(shí)驗(yàn)組 別與空白組比較均表現(xiàn)出極顯著差異（P〈〇. 01)，大豆素高劑量組與模型組及空白組比較有 顯著差異（P〈〇. 05)。
[0187] 在給藥治療期間，各組小鼠體重均在一定范圍內(nèi)波動(dòng)上升并無(wú)明顯差別。
[0188] 在給藥治療期間，除空白組飲食量維持恒定水平，各組小鼠飲食量均表現(xiàn)飲食量 下降的趨勢(shì)。
[0189] 綜上所述，推測(cè)大豆素提取物在給藥劑量71. 07mg/kg、服藥劑量為10天時(shí)，其對(duì) 小鼠 H22肝癌模型具有一定的療效，腫瘤抑制率為31. 96%與環(huán)磷酰胺（31. 44% )比較藥 效略高。通過(guò)小鼠胸腺指數(shù)及脾指數(shù)的比較，我們發(fā)現(xiàn)H22肝癌小鼠模型本身會(huì)降低胸腺 指數(shù)，升高脾指數(shù)，本實(shí)驗(yàn)中大豆素提取物可肝癌模型小鼠胸腺縮小及脾腫大的現(xiàn)象，且該 作用隨著給藥劑量的增加，效果更加明顯。
[0190] 實(shí)驗(yàn)證明，在小鼠給藥期間沒(méi)有致死現(xiàn)象，在一定濃度范圍內(nèi)，大豆素有具有潛在 抗肺癌和抗肝癌腫瘤作用，該作用還并未被發(fā)掘。本發(fā)明提供了該化合物新的應(yīng)用，為新藥 研發(fā)提供理論依據(jù)。
[0191] 本發(fā)明實(shí)施例涉及到的材料、試劑和實(shí)驗(yàn)設(shè)備，如無(wú)特別說(shuō)明，均為符合中藥提取 的市售產(chǎn)品。
[0192] 以上所述，僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員 來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明的核心技術(shù)的前提下，還可以做出改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng) 屬于本發(fā)明的專利保護(hù)范圍。與本發(fā)明的權(quán)利要求書(shū)相當(dāng)?shù)暮x和范圍內(nèi)的任何改變，都 應(yīng)認(rèn)為是包括在權(quán)利要求書(shū)的范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種黃綠蜜環(huán)菌中大豆素單體化合物的提取方法，其特征在于包括以下步驟： (1) 以黃綠蜜環(huán)菌子實(shí)體為原料，經(jīng)干燥并磨成粉末狀后，用乙酸乙酯以液固比 (5-10)mL : lg進(jìn)行浸泡，然后過(guò)濾取上清，得到乙酸乙酯提取液，并濃縮至膏狀； (2) 使用乙醇體積分?jǐn)?shù)為10-35%的正己烷-乙醇二元混合溶劑溶解步驟（1)得到的 膏狀乙酸乙酯提取物，得到100-150mg/mL的上樣溶液； (3) 對(duì)上樣溶液進(jìn)行一維液相色譜分離：采用的色譜柱為Silica正相硅膠色譜柱，采 用的流動(dòng)相為二元混合有機(jī)相，其中A相為正己烷、B相為乙醇，進(jìn)樣量為50-150mL/針，流 動(dòng)相流速為550-600mL/min，檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)210-260nm ;采用的洗脫方式 為B相濃度由0 %至75 %進(jìn)行梯度洗脫45-75min，根據(jù)紫外吸收光譜收集23-26分鐘洗脫 液作為目的組分，減壓濃縮至膏狀，得到一維液相組分； (4) 用乙醇體積分?jǐn)?shù)為2-15%的乙醇-正己烷二元混合溶劑溶解一維液相組分，溶解 至濃度為50-100mg/mL ; (5) 進(jìn)行二維液相色譜分離：采用的色譜柱為Silica正相硅膠色譜柱，采用的流動(dòng)相 為二元混合有機(jī)相，其中A相為正己烷、B相為乙醇，進(jìn)樣量為500-2000 μ L/針，流動(dòng)相流 速為10-30mL/min，檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)210-260nm，采用的洗脫方式為Β相濃度 4%進(jìn)行等度洗脫20-30min，根據(jù)紫外吸收光譜收集13-18分鐘洗脫液作為目的組分，旋轉(zhuǎn) 蒸發(fā)濃縮至干，得到大豆素單體化合物。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的黃綠蜜環(huán)菌中大豆素單體化合物的提取方法，其特征在于： 所述步驟（3)中的Silica正相硅膠色譜柱的尺寸為直徑150mm、柱長(zhǎng)250mm，其中娃球粒徑 為10-50 μ m，使用時(shí)柱溫為室溫或25-40 °C。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的黃綠蜜環(huán)菌中大豆素單體化合物的提取方法，其特征在于： 所述步驟（5)中的Silica正相硅膠色譜柱的尺寸為直徑20mm、柱長(zhǎng)250mm，其中娃球粒徑 為10-50 μ m，使用時(shí)柱溫為室溫或25-40 °C。4. 權(quán)利要求1所述的大豆素單體化合物在制備抗肺癌藥物中的應(yīng)用。5. 權(quán)利要求1所述的大豆素單體化合物在制備抗肝癌藥物中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種黃綠蜜環(huán)菌中大豆素單體化合物的提取方法：以黃綠蜜環(huán)菌子實(shí)體為原料，磨成粉末后乙酸乙酯提取，濃縮至膏狀；用正己烷-乙醇溶劑溶；一維液相色譜分離：采用Silica色譜柱，A相正己烷、B相乙醇二元流動(dòng)相，B相濃度由0％至75％梯度洗脫，收集23-26min洗脫液；用乙醇-正己烷溶劑溶解；二維液相色譜分離：采用Silica色譜柱，A相正己烷、B相乙醇二元流動(dòng)相，B相濃度4％等度洗脫，收集13-18min洗脫液，蒸發(fā)濃縮，得大豆素。該分離方法穩(wěn)定，重復(fù)性高，制備量大，操作簡(jiǎn)單省時(shí)，成本低，大豆素提取率高；目的物對(duì)肺癌A549細(xì)胞和肝癌Hep-G2細(xì)胞具有抑制作用，具有抗癌藥物開(kāi)發(fā)潛力。
【IPC分類】C07D311/36, A61P35/00, C07D311/40
【公開(kāi)號(hào)】CN105601602
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510550952
【發(fā)明人】張耀洲, 王歡歡, 龐莉, 韓朝, 李上文, 馬紅, 楊珊珊, 陸洪, 杜思邈, 蓋其靜
【申請(qǐng)人】天津耀宇生物技術(shù)有限公司
【公開(kāi)日】2016年5月25日
【申請(qǐng)日】2015年9月1日