一種天然酪蛋白多孔水凝膠材料及其制備方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)用水凝膠材料制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種天然酪蛋白多孔水凝膠材料及其制備方法與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]作為一類重要的細(xì)胞支架材料，多孔水凝膠在組織工程領(lǐng)域應(yīng)用廣泛、發(fā)展?jié)摿薮蟆＿@不僅是因?yàn)樗z本身具有與生物組織中的細(xì)胞外基質(zhì)相似的結(jié)構(gòu)和親水性，而且其多孔結(jié)構(gòu)和孔連通性能夠?yàn)榧?xì)胞的生長、增殖、迀移以及組織生長所需營養(yǎng)物質(zhì)與組織代謝物的傳遞提供有利的條件和環(huán)境。如何設(shè)計(jì)制備出生物相容性好、孔結(jié)構(gòu)易于調(diào)控且孔連通性能優(yōu)良的多孔水凝膠細(xì)胞支架材料，是目前生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)和重要課題。
[0003]迄今為止，用于多孔水凝膠的制備方法主要有發(fā)泡法、相分離法和鹽析法，但基于這些方法制得的水凝膠的孔結(jié)構(gòu)通常不易調(diào)控、且孔間連通性較差。相比之下，近年來出現(xiàn)的高內(nèi)相乳液模板法，則可望為性能優(yōu)良的多孔水凝膠支架材料的制備提供一條有效途徑。一般而言，高內(nèi)相乳液的內(nèi)相體積分?jǐn)?shù)可高達(dá)75%、甚至99%，通過交聯(lián)固定這種乳液的連續(xù)相然后除去內(nèi)相，便可獲得高孔隙率的多孔材料;不僅如此，通過調(diào)節(jié)內(nèi)相體積分?jǐn)?shù)，還可有效控制所得水凝膠的孔隙率及孔徑。然而，目前利用高內(nèi)相乳液模板法制備多孔水凝膠支架的研究工作，尚存在以下主要問題:一是制備時(shí)大多使用丙烯酰胺、甲基丙烯酸羥乙酯等聚合單體作為基本原材料，不僅導(dǎo)致所形成的水凝膠基質(zhì)難以生物降解，而且易殘留導(dǎo)致生物毒性;二是為形成有關(guān)高內(nèi)相乳液模板，普遍添加了大量的有機(jī)表面活性劑作為穩(wěn)定劑，致使所制備的多孔水凝膠材料的生物安全性降低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足與缺點(diǎn)，本發(fā)明的首要目的在于提供一種天然酪蛋白多孔水凝膠材料的制備方法，該方法以利用天然酪蛋白的自乳化能力制備的高內(nèi)相乳液為模板，在連續(xù)相中加入H3C/NHS催化酪蛋白間的氨基和羧基的酰胺化交聯(lián)反應(yīng)。
[0005]本發(fā)明的另一目的在于提供上述制備方法制備得到的天然酪蛋白多孔水凝膠材料，該水凝膠材料生物相容性好、具有連通孔、孔結(jié)構(gòu)和孔隙率可控。
[0006]本發(fā)明的再一目的在于提供上述天然酪蛋白多孔水凝膠材料的應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
[0008]—種天然酪蛋白多孔水凝膠材料的制備方法，包含如下步驟:
[0009](I)將酪蛋白水溶液作為水相與油相混合，得到0/W高內(nèi)相乳液；
[0010](2)將步驟(I)制得的0/W高內(nèi)相乳液與EDC.HCl和NHS混合水溶液混合，進(jìn)行酰胺化反應(yīng);然后除雜，得到酪蛋白多孔水凝膠；
[0011 ]步驟(I)中所述的酪蛋白水溶液，優(yōu)選通過如下制備方法制備得到:
[0012]將酪蛋白加入水中，用堿溶液調(diào)pH至7.5?9.5，得到酪蛋白水溶液;所述的堿溶液優(yōu)選為氫氧化鈉溶液；
[0013]步驟(I)中所述的酪蛋白水溶液的質(zhì)量分?jǐn)?shù)優(yōu)選為8.0%?12.5%;
[0014]步驟(I)中所述的水相和油相的體積比為(1:3)?(1:9);
[0015]步驟(I)中所述的油相為正己烷、甲苯、橄欖油中的任意一種；
[0016]步驟(I)中所述的混合優(yōu)選攪拌條件下混合；
[0017]所述的攪拌的速度優(yōu)選為1000rpm;
[0018]步驟(2)中所述的EDC.HCl和NHS混合水溶液中NHS、EDC.HCl與0/W高內(nèi)相乳液中酪蛋白的質(zhì)量比優(yōu)選為9:15:50；
[0019]步驟(2)中所述的EDC.HCl和NHS混合水溶液的體積與步驟(I)中所述的的水相體積比為1:10;
[0020]步驟(2)中所述的酰胺化反應(yīng)的條件優(yōu)選為4?25°C反應(yīng)12?48h;
[0021]步驟(2)中所述的酰胺化反應(yīng)的條件進(jìn)一步優(yōu)選為4°C反應(yīng)24h;
[0022]步驟(2)中所述的除雜的方式優(yōu)選為透析或者抽提；
[0023]所述的抽提的條件優(yōu)選為體積分?jǐn)?shù)為60?80%的乙醇水溶液和水分別抽提12?48h；
[0024]—種天然酪蛋白多孔水凝膠材料，通過上述制備方法制備得到；
[0025]所述的天然酪蛋白多孔水凝膠材料優(yōu)選具有如下特征:有連通孔、孔徑分布為5?120μπι且孔隙率大于75%;
[0026]所述的天然酪蛋白多孔水凝膠材料在組織工程領(lǐng)域中的應(yīng)用；
[0027]所述的天然酪蛋白多孔水凝膠材料不僅生物相容性好、可降解，而且其孔徑及孔隙率易于調(diào)控，適合用作生物組織工程細(xì)胞支架材料；
[0028]本發(fā)明的原理:本發(fā)明以來源豐富、可再生且具優(yōu)良生物安全性和可生物降解性的天然酪蛋白為基本原材料，同時(shí)在不外加有機(jī)表面活性劑情況下，利用天然酪蛋白的自乳化能力原位形成高內(nèi)相乳液模板，再利用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC.HCl)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)催化酪蛋白的羧基和氨基發(fā)生酰胺化反應(yīng)而使連續(xù)相內(nèi)的酪蛋白交聯(lián)形成三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，制備得到一種生物相容性好、具有連通孔且孔結(jié)構(gòu)易調(diào)控的多孔水凝膠細(xì)胞支架材料。
[0029]本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果:
[0030](I)本發(fā)明采用的主要原料為來源豐富、可再生且具優(yōu)良生物安全性和可生物降解性的天然酪蛋白。
[0031](2)本發(fā)明在不外加有機(jī)表面活性劑情況下，利用天然酪蛋白的自乳化能力原位形成高內(nèi)相乳液模板。
[0032](3)本發(fā)明制備的多孔水凝膠可通過油水相體積比控制孔徑及孔隙率，并具有連通孔結(jié)構(gòu)。
[0033](4)本發(fā)明對設(shè)備要求低，適用性廣。
【附圖說明】
[0034]圖1是實(shí)施例1制得的高內(nèi)相乳液的的宏觀狀態(tài)和微觀形貌圖。
[0035]圖2是實(shí)施例1制得的酪蛋白多孔水凝膠材料的光學(xué)顯微鏡形貌圖。
[0036]圖3是實(shí)施例1制得的酪蛋白多孔水凝膠材料的宏觀狀態(tài)和掃描電鏡圖。
[0037]圖4是實(shí)施例1制得的酪蛋白多孔水凝膠材料用作鼻咽上皮細(xì)胞NP69培養(yǎng)支架，細(xì)胞培養(yǎng)Sh后及24h后的細(xì)胞活/死細(xì)胞染色結(jié)果分析圖；其中，A: Sh; B: 24h。
[0038]圖5是實(shí)施例1制得的多孔水凝膠的細(xì)胞相容性評價(jià)分析圖。
[0039]圖6是實(shí)施例2制得的高內(nèi)相乳液的宏觀狀態(tài)和微觀形貌圖。
[0040]圖7是實(shí)施例2制得的酪蛋白多孔水凝膠材料的光學(xué)顯微鏡形貌圖。
[0041 ]圖8是實(shí)施例2制得的酪蛋白多孔水凝膠材料的宏觀狀態(tài)和掃描電鏡圖。
[0042]圖9是實(shí)施例2制得的酪蛋白多孔水凝膠材料用作鼻咽上皮細(xì)胞NP69培養(yǎng)支架，細(xì)胞培養(yǎng)8小時(shí)后及24小時(shí)后的細(xì)胞活/死細(xì)胞染色結(jié)果分析圖；其中，A:8h;B:24h。
[0043]圖10是實(shí)施例2制得的多孔水凝膠的細(xì)胞相容性評價(jià)分析圖。
[0044]圖11是實(shí)施例3制得的高內(nèi)相乳液的宏觀狀態(tài)和微觀形貌圖。
[0045]圖12是實(shí)施例3制得的酪蛋白多孔水凝膠材料的光學(xué)顯微鏡形貌圖。
[0046]圖13是實(shí)施例3制得的酪蛋白多孔水凝膠材料的宏觀狀態(tài)和掃描電鏡圖。
[0047]圖14是實(shí)施例3制得的酪蛋白多孔水凝膠材料用作鼻咽上皮細(xì)胞NP69培養(yǎng)支架，細(xì)胞培養(yǎng)8小時(shí)后及24小時(shí)后的細(xì)胞活/死細(xì)胞染色結(jié)果分析圖；其中，A:8h;B:24h。
[0048]圖15是實(shí)施例3制得的多孔水凝膠的細(xì)胞相容性評價(jià)分析圖。
【具體實(shí)施方式】
[0049]下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。
[0050]實(shí)施例1
[0051 ] (1)0.1g酪蛋白加入水中，用氫氧化鈉溶液調(diào)pH至8.0，配制1wt%的酪蛋白水溶液；
[0052](2)將ImL步驟(I)制得的酪蛋白水溶液(水相)與4mL正己烷(油相)混合，在
IOOOOrpm條件下攪拌，得到0/W高內(nèi)相乳液；
[0053](3)將步驟(2)制得的0/W高內(nèi)相乳液與0.lmL含0.03g EDC.HCl和0.018g NHS的水溶液混合并攪拌混勻，置于4°C下反應(yīng)24h，用體積分?jǐn)?shù)為65%的乙醇水溶液和水分別抽提24h，得到天然酪蛋白多孔水凝膠材料；
[0054]圖1A為步驟(2)制得的酪蛋白穩(wěn)定的高內(nèi)相乳液的宏觀狀態(tài)圖，如圖所示，為乳白色粘稠乳液;在光學(xué)顯微鏡下觀察乳液的微觀形貌，結(jié)果如圖1B所示:液滴間呈密堆積，具有典型的尚內(nèi)相乳液特點(diǎn)；
[0055]利用光學(xué)顯微鏡觀察步驟(3)制得的天然酪蛋白多孔水凝膠材料的形貌，結(jié)果如圖2所示:水凝膠具有圓形的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，是高內(nèi)相乳液模板的作用；
[0056]圖3A為步驟(3)制得的天然酪蛋白多孔水凝膠材料的宏觀狀態(tài)圖；用液氮對步驟(3)制得的水凝膠材料進(jìn)行冷凍處理，真空凍干機(jī)干燥，用掃描電鏡(SEM)S-4800(日本JEOL公司)觀察天然酪蛋白多孔水凝膠材料的孔形貌，并測定其孔徑，結(jié)果如圖3B所示:水凝膠具有連通孔結(jié)構(gòu)，孔徑范圍在5?120μπι;使用乙醇置換法測得孔隙率為82.5%；
[0057]細(xì)胞增殖觀察:用KSF培養(yǎng)液培養(yǎng)ΝΡ69鼻咽上皮細(xì)胞(購自上海信裕生物技術(shù)有限公司)24小時(shí)至對數(shù)生長期，將天然酪蛋白多孔水凝膠材料置于24孔板，用聚四氟乙烯環(huán)固定;在其中接種對數(shù)生長期細(xì)胞，每孔I X 14個細(xì)胞;37°C培養(yǎng)8小時(shí)和24小時(shí)后，吸棄上清液，用PBS清洗2次；向板內(nèi)(含ImLPBS液)加入1yL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.01 %的AO/EB