A通用引物進行PCR擴增。
[0110] PCR引物為：27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3'）和 1492R(5'_ GGTTACCTTGTTACGACTT-3 '）進行擴增。
[0111] PCR反應(yīng)體系： 27F 1 .Ομ,Ι 1492R Ι.ΟμΙ I 〇χ buffer 5μ1 dNTP 4.0μ1 C〇112] Taq 酶 0 5μ1 DNA模板 ΙμL ddH2Q 38.5μ1 總體系 50.0μ1
[0113]反應(yīng)條件： ① 94°C 4min ② 94°C 50 s (3)52 °C lmin
[0m]④ 72。。 IminSOs ⑤go to②③④ for 35 circles ?1TC 14mm ⑦ 4°C forever
[0115] PCR擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物（圖3所示hPCR產(chǎn)物送華大科技 有限公司測序，降解菌的16S rDNA序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行Blast比對，選取序列相似性較 高的菌株，采用MEGA6.0的Ne i ghbor-j 〇 i n i ng法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。
[0116] 序列比對結(jié)果表明，BCB4的16s rDNA序列與解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens)的16S rDNA序列相似度為98%，其系統(tǒng)發(fā)育樹如圖4所示。
[0117] 實驗例3
[0118]解淀粉芽孢桿菌BCB4的纖維素酶活測定
[0119] 1、將實施例1~3中在液體種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)得到的BCB4按1 %的接種量接種到 100mL產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，搖床37°C，150r/min培養(yǎng)4d，發(fā)酵液4000r/min離心10min，取上清液作 為粗酶液。測定降解菌的纖維素酶活性。
[0120] (1)全酶活(FPA)的測定
[0121] 每組取4支20mL刻度的試管編號，各加50mg無淀粉濾紙，再加1.5mL 0.2MpH4.8醋 酸緩沖液。向1號試管中加入2mL DNS溶液以鈍化酶活性，作為空白對照。將4支試管同時在 50 °C水浴中預(yù)熱5~1 Omin，再各加入適當稀釋后的酶液0.5mL，50 °C水浴中保溫1 h。
[0122] (2)外切酶活(&)的測定
[0123] 每組取4支20mL刻度的試管編號，各加50mg脫脂棉，再加1.5mL 0.1M pH 5.0檸檬 酸緩沖液。1號試管中加入2mL DNS溶液以鈍化酶活性，作為空白對照。將4支試管同時在50 。(:水浴中預(yù)熱5~10min，再各加入適當稀釋后的酶液0.5mL，50 °C水浴中保溫24h。
[0124] (3)內(nèi)切酶活(Cx)活力的測定
[0125] 每組取4支20mL刻度的試管編號，各加1.5mL 0.51%CMC pH4.8檸檬酸緩沖液。1號 試管中加入2mL DNS溶液以鈍化酶活性，作為空白對照。將4支試管同時在50°C水浴中預(yù)熱5 ~1 Omin，再各加入適當稀釋后的酶液0.5mL，50 °C水浴中保溫30min。
[0126] (4)葡萄糖苷酶活力的測定
[0127] 每組取4支20mL刻度的試管編號，各加1.5mLl %水楊苷pH4.8醋酸緩沖液。1號試管 中加入2mL DNS溶液以鈍化酶活性，作為空白對照。將4支試管同時在50°C水浴中預(yù)熱5~ 1 Omin，再各加入適當稀釋后的酶液0.5mL，50 °C水浴中保溫30min。
[0128] 上述反應(yīng)時間結(jié)束后，立即取出并向2、3、4號試管中各加入2mL DNS溶液以終止酶 反應(yīng)，充分搖勻后沸水浴5min，冷卻后用蒸餾水定容至20mL，充分混勻。用對照調(diào)零點，在 540nm波長下測定2、3、4號試管液的0D值，在葡萄糖標準曲線上查出相應(yīng)的葡萄糖量，根據(jù) 葡萄糖量計算出酶活力。
[0129]
[0130] 發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)4d后測定篩選菌株的纖維素酶活性，BCB4的濾紙酶(FPA)、內(nèi)切葡 聚糖酶(CMCase)、外切葡聚糖酶(Ci)、葡萄糖苷酶(β-Gase)酶活分別為(實施例1~3均值） 13.81U · g-\174.42U · g-\0.83U · g-\52.85U · g-、
[0131] 2、葡萄糖標準曲線測定
[0132] 取8支20mL刻度的試管，分別加入lmg/mL的葡萄糖標準溶液OmL，0.2mL，0.4mL， 0.6mL，0.8mL，1 .OmL，1.2mL，1.4mL，補加蒸餾水至總體積為2mL，配制成濃度梯度的葡萄糖 溶液。向各試管中加入2mLDNS溶液，搖勻后沸水浴5min，立即取出冷卻，用蒸餾水定容至 20mL。在540nm下，以1號試管溶液作為對照調(diào)零點，測定其它各管溶液的0D值并記錄結(jié)果。 以葡萄糖含量(mg)為橫坐標，以對應(yīng)的0D值為縱坐標，繪制葡萄糖標準曲線（圖5)。
[0133] 實驗例4
[0134] 解淀粉芽孢桿菌BCB4菌株對菌渣栽培雙孢蘑菇的堆肥效應(yīng)
[0135] 取實施例5中的杏鮑菇菌渣堆肥方法(編號為B)與對比例CK，對比例A進行比較，三 者除菌劑以外其他操作均相同（如表2所示）。
[0136] 表2實驗處理方案
[0137]
[0138] 1、菌渣堆制發(fā)酵溫度變化
[0139] -次發(fā)酵過程中，自建堆開始，每天9:00和16:00用水銀溫度計測定堆體大約60cm 深的部位，每次隨機選3個點測量溫度，然后取平均溫度作為堆體實際溫度。
[0140] 溫度可以作為判斷微生物活動強弱的指標。本試驗結(jié)果表明（圖6)，不同處理堆肥 溫度的總體變化相似。在整個堆制發(fā)酵過程中，添加了菌劑的處理A和處理B的溫度與CK相 比，高5°C左右，在翻堆后，CK溫度變化較大，而處理A、B溫度變化較小。表明菌渣發(fā)酵過程加 入BCB4組合發(fā)酵菌劑，有利于溫度的升高和穩(wěn)定。
[0141] 2、菌渣發(fā)酵過程pH變化
[0142] pH值采用水樣比10:1攪拌lh后靜置，取上清用便攜式pH計測定，每個樣品三個重 復。
[0143] 培養(yǎng)料在一次翻堆后加入過磷酸鈣，且預(yù)濕過程微生物分解有機物產(chǎn)生有機酸， 所以發(fā)酵初始pH偏酸，隨著發(fā)酵過程微生物分解作用產(chǎn)生氨氣使堆體pH開始上升（圖7)。處 理A、B在二次翻堆后pH快速上升，可能是添加 BCB4組合發(fā)酵菌劑，堆肥中微生物有利于含氮 有機物分解，產(chǎn)生的大量氨使pH升高。
[0144] 3、菌渣發(fā)酵過程含氮量、含碳量變化
[0145] 發(fā)酵過程含氮、含碳量見(表3 )，從試驗結(jié)果來看，含氮量在發(fā)酵過程中逐漸增加， 處理A、B和CK含氮量分別從開始的1.55%、1.54%、1.58 %增加到二次發(fā)酵結(jié)束時的 1.75%、1.71 %、1.70%，但是二次發(fā)酵結(jié)束后，處理A、B與CK之間無明顯差異;含碳量在逐 漸減小，二次發(fā)酵結(jié)束處理A、B的含碳量明顯低于CK。
[0146] 表3堆肥過程中含氮、含碳量（％ )
[0147]
[0148] 由此可見，菌渣發(fā)酵過程加入BCB4組合發(fā)酵菌劑，堆肥中含N量高于對照。
[0149] 4、雙孢蘑菇產(chǎn)量統(tǒng)計
[0150] 將發(fā)酵后的菌渣，每個處理分成3份，隨機放置菇架上進行鋪料，鋪料至厚度在 20cm左右，料溫穩(wěn)定在28°C左右，原料顏色正常，發(fā)酵氣味正常播種，播種量350g/m 2。播種 后20d左右.菌絲長滿培養(yǎng)料，覆3cm左右厚的預(yù)濕紅土(其中加草炭土3%、石灰1 % )，補充 水分，使培養(yǎng)料水分維持在65%左右。覆土后按常規(guī)技術(shù)進行出菇管理，16d左右出菇，統(tǒng)計 前3潮燕的產(chǎn)量(表4)。
[0151] 表4不同處理雙孢蘑菇產(chǎn)量
[0152]
[0153] 從表4可知，處理A、B的總產(chǎn)量與CK相比略有提高，但總產(chǎn)量差異不顯著?？梢?，表 明菌渣發(fā)酵過程加入BCB4組合發(fā)酵菌劑，有利于提高菌渣堆肥質(zhì)量，從而提高雙孢蘑菇產(chǎn) 量。
[0154] 實驗例5
[0155] 解淀粉芽孢桿菌BCB4菌株對菌渣堆肥的肥力效應(yīng)
[0156] 以實施例6為實驗基礎(chǔ)，分為四個處理組：
[0157] 處理A:菌渣直接堆制發(fā)酵，含水率維持在60 %左右。
[0158] 處理B(實施例6):菌渣79%，畜禽糞20%，堆肥菌劑（（BCB4+NFB7+BCB2)混合菌劑） 5L，尿素1 %左右，含水率維持在60 %左右。
[0159] 處理C:菌渣89%，堆肥菌劑(用量參照使用說明），含水率維持在60%左右。
[0160] 處理D:菌渣原樣，不發(fā)酵。
[0161] 整個堆肥階段，應(yīng)該嚴格監(jiān)視堆肥溫度變化(通過在堆肥上安插不同深度的溫度 計進行控制），并測定pH值、電導率、有機質(zhì)、全氮、全磷、全鉀以及速效N\P\K，以檢驗堆肥效 果。堆肥結(jié)束后，各處理作為玉米基肥分別施入玉米地，測定其肥力效果。
[0162] 實驗結(jié)果
[0163] 1、菌渣堆肥發(fā)酵效果
[0164] 1.1、堆肥過程中溫度的變化情況
[0165] 堆肥的溫度變化是堆肥微生物活動和堆肥進程的最直觀反映，同時也是堆肥快速 腐熟的一個重要參數(shù)。本項目通過加牛糞、加菌劑處理進行堆肥示范。示范效果表明添加了 牛