用于哺乳動物來源的神經(jīng)膠質限制性祖細胞的擴增、鑒定、表征和效能增強的方法和組合物的制作方法
【專利說明】用于晡乳動物來源的神經(jīng)膠質限制性祖細胞的擴增、鑒定、表征和效能增強的方法和組合物
[0001 ] 本申請為國際申請日2010年11月9日、國際申請?zhí)朠CT/US2010/055956于2012年5月11日進入中國國家階段、申請?zhí)?01080051269.2、發(fā)明名稱“用于哺乳動物來源的神經(jīng)膠質限制性祖細胞的擴增、鑒定、表征和效能增強的方法和組合物”的分案申請。
[0002]本專利申請要求2010年4月22日提交的序列號為61/326,799的美國臨時申請和2009年11月12日提交的序列號為61/260，441的美國臨時申請的優(yōu)先權益，所述每個臨時申請的教導內容在此以其全文引為參考。
技術領域
[0003]本發(fā)明提供了用于制造哺乳動物來源的神經(jīng)膠質限制性祖細胞(GRP)群的方法，以及使用這些細胞的方法，所述細胞群具有減少的可能不想要的細胞表型和/或降低的群細胞中的標準偏差。在本發(fā)明中還提供了用于表征GRP的抗體組及其在表征GRP細胞中的使用方法。
【背景技術】
[0004]神經(jīng)膠質限制性祖細胞(GRP)由它們與抗體A2B5的反應性來確定，所述抗體識別C-系列神經(jīng)節(jié)苷脂亞組(Dietrich等，Glia 2002 40: 65-77 ;Rao和Mayer-Proschel,Dev.B1l.1997 188:48_63;3&;[1:0等，]\如111'0。116111.2001 78:64_74;Windrem 等，Nat.Med.2004 10:93-97) ARP的其它抗原性特征包括星形細胞標志物膠質原纖維酸性蛋白(GFAP)的中度表達和神經(jīng)元標志物E-CAM(多唾液酸化N-CAM或PSA-NCAM)和β-1II微管蛋白(TuJI)的低表達(Di etr i ch等，Gl ia 2002 40: 65-77 ; Rao和Mayer-Proschel，Dev.B1l.1997 188:48-63)。
[0005]在GRP被分離時，它們已經(jīng)內源性分化至超出神經(jīng)干細胞的范圍，成為定型的譜系限制性細胞。尚未觀察到GRP誘導或產(chǎn)生畸胎瘤。
[0006]腦和脊髓中非常重要的一類神經(jīng)元包括那些軸突被包裹在髓磷脂中的神經(jīng)元。當該髓鞘受損時，其生命過程構成神經(jīng)元軸突周圍的絕緣性髓磷脂層的少突神經(jīng)膠質細胞被破壞。脫髓鞘的神經(jīng)元不能正確傳導信號，并最終將死亡。
[0007]當損壞不完全時，內源性修復機制被激活，引起髓鞘重新形成和功能部分或完全恢復(Lassmann 等，Mult.Scler.1997 3:133-136; Prineas 和Conne 11 ,Ann.Neurol.19795:22-31)。這證實了髓鞘重新形成確實能導致功能恢復這一關鍵點。然而，由于各種疾病或創(chuàng)傷而發(fā)生脫髓鞘的大多數(shù)患者不發(fā)生足夠的內源性重新形成髓鞘(Prineas等，Ann.Neuro1.1993 33:137-151)，并且盡管存在大量需求和努力，但在開發(fā)能夠幫助恢復喪失的功能的產(chǎn)品方面幾乎沒有獲得進展。這可以部分歸因于為了在體內實現(xiàn)受損的產(chǎn)髓磷脂少突神經(jīng)膠質細胞的再生，必須存在大量信號和復雜的細胞間相互作用。重要的是，在脫髓鞘的動物模型中，引起髓鞘重新形成的細胞療法已被證明是有益的。
[0008]Totoiu 等(Exp.Neurol.2004 187: 254-265)報道了在病毒誘導的鼠 MS 模型中鼠GRP的局部移植物在治療脊髓病變中的益處。GRP迀移并分化成少突神經(jīng)膠質細胞，引起看起來與軸突保留相關的髓鞘重新形成。他們也觀察到運動的改善。后續(xù)研究(Hardison等，Exp.Neurol.2006 197:420-429)證實了鼠GRP能夠在炎性T細胞和巨噬細胞兩者存在下存活并重新形成髓鞘。
[0009]由于髓磷脂堿性蛋白編碼基因突變而表現(xiàn)出正常髓磷脂產(chǎn)生缺陷的戰(zhàn)栗小鼠(shiverer mouce)是用于研究外源性細胞移植物對髓磷脂產(chǎn)生的影響的模型。通過戰(zhàn)栗小鼠中的細胞移植，證實了髓磷脂產(chǎn)生與許多脫髓鞘疾病包括TM和MS以及髓鞘形成障礙相關。已顯示，人GRP在圍產(chǎn)期異種移植后能在戰(zhàn)栗小鼠腦中廣泛并高效地形成髓鞘(Windrem等，Nat.Med.2004 10:93-97)。證實了分化成區(qū)域適合的細胞類型(星形細胞和少突神經(jīng)膠質細胞)，并且沒有腫瘤的跡象。對這些研究進行了擴展以顯示腦和脊髓兩者的髓鞘重新形成，其在部分移植動物中伴有顯著的表型援救(Windrem等，Cell Stem Cell 2008 2:553-565) ο

【發(fā)明內容】

[0010]本發(fā)明的一個方面涉及用于制造哺乳動物神經(jīng)膠質限制性祖細胞(GRP)的方法。
[0011]本發(fā)明的另一方面涉及用于減少GRP細胞群中的不想要的細胞表型和/或降低GRP細胞群細胞中的標準偏差的方法。
[0012]本發(fā)明的另一方面涉及用于表征GRP細胞的抗體組，以及使用該抗體組將細胞表征為GRP細胞的方法，所述抗體組包含針對c系列神經(jīng)節(jié)苷脂(使用A2B5抗體)、GFAP的抗體以及選自 01181、01182、01、卩06卩1?-0、巢蛋白(1168^11)、吣2、？5厶-從^1、1\^1、燈-67和恥_的一種或多種抗體。
[0013]本發(fā)明的另一方面涉及可用于表征GRP細胞的基因表達譜。
[0014]本發(fā)明的另一方面涉及用于制造A2B5陽性細胞缺失的哺乳動物神經(jīng)細胞的方法。
[0015]本發(fā)明的另一方面涉及用于使用這些制造的哺乳動物GRP細胞產(chǎn)生星形細胞和/或少突神經(jīng)膠質細胞的方法。
[0016]本發(fā)明的另一方面涉及用于使用這些制造的哺乳動物GRP細胞在患有與神經(jīng)元脫髓鞘相關的疾病、障礙、損傷和損壞的哺乳動物中增加神經(jīng)元的髓鞘重新形成的方法。
[0017]本發(fā)明的另一方面涉及用于使用這些制造的哺乳動物GRP細胞減少神經(jīng)膠質瘢痕形成的方法。
[0018]本發(fā)明的又一方面涉及用于在哺乳動物中使用這些制造的哺乳動物GRP細胞治療神經(jīng)變性疾病或障礙或神經(jīng)系統(tǒng)或其一部分的損壞或損傷的方法。
【附圖說明】
[0019]圖1A、1B和IC顯示了按照本發(fā)明制造的三個獨立細胞制備物的試驗規(guī)模生長曲線。
[0020]圖2A和2B顯示了按照本發(fā)明制造的細胞的生產(chǎn)規(guī)模生長曲線。
[0021 ]圖3A和3B顯示了細胞在懸液與聚L-鳥氨酸處理的表面上的存活率(圖3B)以及在每次傳代和最終收獲時的存活率(圖3A)的比較。
【具體實施方式】
[0022]本發(fā)明提供了用于制造哺乳動物神經(jīng)膠質祖細胞(GRP)的方法。在文獻中，GRP也被稱為神經(jīng)膠質限制性前體細胞或神經(jīng)膠質祖細胞。
[0023]本發(fā)明的哺乳動物GRP細胞可以源自于能夠產(chǎn)生A2B5陽性細胞的任何哺乳動物組織源。這樣的哺乳動物組織源的實例包括但不限于胚胎/胎兒和成體(包括出生后的所有年齡)源，其全都來自于包括但不限于神經(jīng)、腦、脊髓、視神經(jīng)、嗅上皮、內分泌腺、皮膚、肌肉、脂肪、結締組織、胎盤、臍帶血、血液、骨髓、骨、胚胎干細胞和誘導的多能細胞的組織。所謂能夠產(chǎn)生A2B5陽性細胞，它指的是包括分化成A2B5陽性細胞的哺乳動物組織源、去分化成A2B5陽性細胞的哺乳動物組織源、以及去分化然后分化成A2B5陽性細胞的哺乳動物組織源。
[0024]根據(jù)本發(fā)明，哺乳動物神經(jīng)膠質限制性祖細胞(GRP)通過從能夠產(chǎn)生A2B5陽性細胞的哺乳動物組織源中分離A2B5抗體反應性細胞來制造。然后將A2B5陽性細胞在基質上體外培養(yǎng)大于6天(DIV)。然后收獲培養(yǎng)的細胞。
[0025]在本發(fā)明的一個實施方案中，所述方法包括將哺乳動物神經(jīng)組織例如但不限于胎兒尸體前腦組織、胎兒尸體脊髓組織、哺乳動物腦或脊髓活檢組織等解離成細胞懸液。在一個實施方案中，哺乳動物神經(jīng)組織在神經(jīng)管閉合后獲得。對于人GRP來說，神經(jīng)組織在例如妊娠約14至約24周時神經(jīng)管閉合后獲得，此時，組織被證實產(chǎn)生一致的產(chǎn)物。按照已知方法通過酶法、機械法或酶法與機械法兩者進行解離。
[0026]A2B5抗體反應性細胞能通過本技術領域的專業(yè)人員已知的各種手段來分離。例如，在一個實施方