一種非經(jīng)典分泌蛋白及其在蛋白分泌表達(dá)中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種在枯草芽孢桿菌中通過(guò)非經(jīng)典分泌途徑 進(jìn)行分泌的異源蛋白，以及利用該蛋白作為轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)在枯草芽孢桿菌中分泌表 達(dá)的一種新型策略。
【背景技術(shù)】
[0002] 枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)是工業(yè)生產(chǎn)中重要的蛋白質(zhì)生產(chǎn)菌株。因?yàn)?強(qiáng)大的蛋白質(zhì)分泌能力、安全菌種的定位(GRAS, generally recognized as safe)、遺傳 易操作性、無(wú)密碼子偏好性以及發(fā)酵成本低廉等特征，枯草芽孢桿菌吸引了眾多科學(xué)研究 者的目光。在枯草芽孢桿菌中，大多數(shù)蛋白質(zhì)以未折疊狀態(tài)通過(guò)Sec途徑被轉(zhuǎn)運(yùn)到胞外，少 數(shù)蛋白（如PhoD和YwbN)以折疊狀態(tài)通過(guò)Tat途徑分泌到培養(yǎng)基中，還有一些蛋白通過(guò)ABC轉(zhuǎn) 運(yùn)子途徑、Com途徑和ESX途徑等方式進(jìn)行分泌。目前，在蛋白分泌相關(guān)研究中，絕大多數(shù)蛋 白是在經(jīng)典信號(hào)肽(Sec信號(hào)肽或Tat信號(hào)肽)的指導(dǎo)下分泌到胞外，但是大多蛋白質(zhì)的分泌 效果往往并不理想。在經(jīng)典分泌途徑(Sec途徑和Tat途徑等）中的每一過(guò)程均可能成為限制 蛋白質(zhì)分泌的因素。此外，一般情況下，細(xì)胞質(zhì)蛋白即使在信號(hào)肽的指導(dǎo)下也很難被分泌到 細(xì)胞外的培養(yǎng)基中。以上因素限制了枯草芽孢桿菌在蛋白質(zhì)生產(chǎn)上的應(yīng)用。
[0003] 除了可通過(guò)上述已知分泌途徑分泌的蛋白，細(xì)菌中還存在一些不帶有任何信號(hào)肽 及其它分泌信號(hào)的分泌型蛋白，這些蛋白的分泌機(jī)制尚不清楚，因此被稱為非經(jīng)典分泌蛋 白。通過(guò)計(jì)算機(jī)軟件計(jì)算，枯草芽孢桿菌可以分泌大約300種蛋白質(zhì)。到目前為止，在枯草芽 孢桿菌中，通過(guò)2D-電泳和質(zhì)譜技術(shù)已鑒定出113種分泌蛋白，其中84種含有經(jīng)典的信號(hào)肽 (Sec信號(hào)肽和Tat信號(hào)肽)并在信號(hào)肽的指導(dǎo)下分泌到胞外;而其它分泌蛋白卻均不含有任 何經(jīng)典的信號(hào)肽或分泌信號(hào)序列。Antelman等通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定出了 17種可分泌到胞外 的典型細(xì)胞質(zhì)蛋白（Antelman et al. Microbial Proteomics: Functional Biology of Whole Organisms 2006，John Wiley & Sons, Inc.，Hoboken, NJ, USA);Tjalsma等列 舉了 24種不帶有信號(hào)肽且可分泌到胞外的蛋白質(zhì)，并認(rèn)為在細(xì)菌中不依賴信號(hào)肽的蛋白分 泌現(xiàn)象可能比之前認(rèn)為的更為普遍（1'」&1811^6七31.]\1；[(31'013；[01.]\1〇1.13；[01.1^￥· 2004，68: 207)。￥:11^1?1；[11611等在枯草芽孢桿菌中對(duì)折疊酶?『84進(jìn)行結(jié)構(gòu)功能分析時(shí)發(fā)現(xiàn) 了一些非經(jīng)典分泌蛋白，比如糖類代謝相關(guān)的蛋白Eno、PdhB、PdhD和CitH，目前尚不知這些 蛋白在胞外是否具有功能（Vitikainen et al. J Biol Chem 2004，279:19302-19314)。 Antelman等最初發(fā)現(xiàn)涉及氨基酸代謝的酶RocA和RocF是通過(guò)非經(jīng)典途徑分泌的(Antelman et al· Genome Res 2001，11:1484-502)，但是后來(lái) Vitikaimen 證明只有 RocF是非經(jīng)典分 泌蛋白。Hirose等鑒定出具有運(yùn)動(dòng)性和趨藥性的蛋白Hag是存在胞外的（Hirose et al. Microbiology 2000，146:65-75)，隨后同類蛋白FIgK和FIiD也被鑒定位于胞外（Antelman et al. Genome Res 2001，11:1484-502)，這三種蛋白在胞外均具有已知功能。過(guò)氧化氫 酶KatA缺少信號(hào)肽，因此開始被認(rèn)為是一種胞內(nèi)酶，但是其后來(lái)被證明同樣可以分泌到胞 外（占總蛋白的56%)(Naclerio et al· Appl Environ Microbiol 1995，61:4471-4473)。 此外，S0dA、YceD、Ef-G和GroEL等蛋白也被不同研究人員在胞外檢測(cè)到。當(dāng)然，在胞外環(huán)境 中檢測(cè)到非經(jīng)典分泌蛋白很容易被認(rèn)為是細(xì)胞裂解而導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)蛋白發(fā)生泄漏的緣故。然 而，Yang等人已證實(shí)一種異源的蛋白Est55和幾種不含有信號(hào)肽的自身細(xì)胞質(zhì)蛋白不是因 為細(xì)胞裂解而泄漏到胞外，而是通過(guò)一種或某種未知的分泌途徑被轉(zhuǎn)運(yùn)到胞外環(huán)境中 (Yang et al. Journal of Bacteriology 2011，193:5607-5615)。事實(shí)上，眾多來(lái)自不同 研究組關(guān)于不同菌種的研究已表明非經(jīng)典分泌蛋白在枯草芽孢桿菌中是真實(shí)存在的。 [0004]盡管非經(jīng)典分泌的機(jī)制尚未清楚，但是研究人員已開始嘗試將非經(jīng)典分泌系統(tǒng)應(yīng) 用到蛋白生產(chǎn)中。最近，Wang等人選擇了 4種枯草芽孢桿菌自身非經(jīng)典分泌蛋白來(lái)嘗試引導(dǎo) 異源蛋白分泌，結(jié)果4種蛋白均可以引導(dǎo)Nsp(Nucleoskeletal like protein)分泌到胞外， 其中2種可以指導(dǎo)堿性磷酸酶PhoA的分泌，一種可以將耐高溫β-半乳糖苷酶BgaB轉(zhuǎn)運(yùn)到胞 外(此即6七&1.]\^(^〇13〇611?&(^2015，14:179)。盡管這些蛋白的分泌量大多很低，只 能用Western-blotting的方法進(jìn)行檢測(cè)，但是證明了非經(jīng)典分泌蛋白可以應(yīng)用在蛋白質(zhì)分 泌表達(dá)中。因此，為了補(bǔ)充枯草芽孢桿菌的蛋白分泌途徑，以及拓展枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng) 的使用范圍，更多的非經(jīng)典分泌蛋白需要被發(fā)掘并應(yīng)用到重組蛋白的生產(chǎn)中。本發(fā)明證明 了來(lái)源于瘤胃菌Ruminococcus sp. 5_1_39B_FAA的D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶RDPE是一種 在枯草芽孢桿菌中的非經(jīng)典分泌蛋白，并以該非經(jīng)典分泌蛋白為分泌信號(hào)引導(dǎo)多個(gè)不同來(lái) 源的目標(biāo)蛋白實(shí)現(xiàn)了在枯草芽孢桿菌中的分泌表達(dá)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的之一是證明來(lái)源于瘤胃菌Ruminococcus sp. 5_1_39B_FAA的D-阿 洛酮糖3-差向異構(gòu)酶RDPE是一種在枯草芽孢桿菌中可通過(guò)非經(jīng)典分泌途徑進(jìn)行分泌的蛋 白。
[0006] 所述的非經(jīng)典分泌途徑不是枯草芽孢桿菌中Sec途徑和Tat途徑等已知經(jīng)典分泌 途徑，也不是因?yàn)榧?xì)胞自溶和裂解而導(dǎo)致的胞內(nèi)蛋白泄漏的現(xiàn)象，而是一種未知的全新的 蛋白分泌途徑。
[0007] 所述的異源蛋白R(shí)DPE的核酸序列如SEQ ID NO. 1所示，且其不含有經(jīng)典的信號(hào)肽 和分泌信號(hào)序列。
[0008] 所述的枯草芽孢桿菌可以是枯草芽孢桿菌168、WB600、WB700、WB800、1A751、DB104 或以上菌株后代細(xì)胞中的一種。
[0009] 本發(fā)明的目的之二是提供一種利用非經(jīng)典分泌蛋白R(shí)DPE并通過(guò)非經(jīng)典分泌途徑 實(shí)現(xiàn)蛋白分泌表達(dá)的方法，即非經(jīng)典分泌蛋白R(shí)DPE在蛋白分泌表達(dá)中的應(yīng)用，是將RDPE與 候選目標(biāo)蛋白進(jìn)行融合并構(gòu)建一系列重組表達(dá)質(zhì)粒PMA5-RDPE-TP，分別轉(zhuǎn)化到枯草芽孢桿 菌菌株后進(jìn)行篩選培養(yǎng)，多達(dá)50%的目標(biāo)蛋白可成功分泌到胞外。
[0010] 所述的重組表達(dá)質(zhì)粒PMA5-RDPE-TP包含非經(jīng)典分泌蛋白R(shí)DPE的編碼序列、21-bp 的柔性Linker序列和目標(biāo)蛋白的編碼序列融合而獲得的DNA序列。
[0011] 所述的重組表達(dá)質(zhì)粒PMA5-RDPE-TP中的21-bp的柔性Linker序列為5'- GGTAGCGGTGGAGGTGGCAGC-3,。
[0012]所述的重組表達(dá)質(zhì)粒PMA5-RDPE-TP中的目標(biāo)蛋白分別為來(lái)枯草芽孢桿菌來(lái)源的
[0013] 所述的重組表達(dá)質(zhì)粒PMA5-RDPE-TP還包含組成型強(qiáng)啟動(dòng)子PHpaii。
[0014] 所述的重組表達(dá)質(zhì)粒pMA5-RDPE-TP還包含氨芐青霉素和卡那霉素抗性選擇標(biāo)記 基因。
[0015] 本發(fā)明的目的之三是提供一種構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒PMA5-RDPE-TP的方法，是構(gòu)建包 含非經(jīng)典分泌蛋白R(shí)DPE的編碼序列、21-bp的柔性Linker序列和目標(biāo)蛋白的編碼序列融合 而獲得的DNA序列的質(zhì)粒。
[0016] 所述構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒PMA5-RDPE-TP的方法包括如下步驟： 1、以各相應(yīng)來(lái)源菌種的基因組或質(zhì)粒，利用對(duì)應(yīng)引物擴(kuò)增groES，groEL，dnaK， dnaj, xylA, pel, phoA (BS), 1ipA, phoD, ywbN, prsA, lacZ, phoA(EC), bgaB, amyS, amyL, gfp and rfp基因，通過(guò)膠回收分別獲得相應(yīng)基因片段。
[0017] 2、以pMA5-RDPEL為模板，使用相應(yīng)引物進(jìn)行PCR，通過(guò)膠回收獲得線性化的載體 pMA5-RDPEL〇
[0018] 3、將各基因片段分別與線性化的載體PMA5-RDPEL進(jìn)行P0E-PCR (Prolonged overlap extension PCR),得到融合產(chǎn)物。
[0019] (1)將融合產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5a，分別得到對(duì)應(yīng)的重組表達(dá)質(zhì) 粒pMA5-RDPE-GroES、pMA5-RDPE-GroEL、pMA5-RDPE-DnaK、pMA5-RDPE-DnaJ、pMA5-RDPE-XylA、pMA5-RDPE-Pel、pMA5-RDPE-PhoA(BS)、pMA5-RDPE-LipA、pMA5-RDPE-PhoD、pMA5-RDPE-YwbN、pMA5-RDPE-PrsA，pMA5-RDPE-lacZ、pMA5-RDPE-PhoA(EC)、pMA5-RDPE-BgaB、 pMA5-RDPE-AmyS、pMA5-RDPE-AmyL、pMA5-RDPE-GFP和pMA5-RDPE-RFP。
[0020] 本發(fā)明的目的之四是提供一種表達(dá)融合蛋白R(shí)DPE-TP的方法，是以重組表達(dá)了融 合蛋白R(shí)DPE-TP的枯草芽孢桿菌為生產(chǎn)菌株，發(fā)酵生產(chǎn)融合蛋白R(shí)DPE-TP。
[0021] 所述的方法是，構(gòu)建表達(dá)融合蛋白R(shí)DPE-TP的重組枯草芽孢桿菌菌株;發(fā)酵培養(yǎng)基 為2.0%~4.0%蛋白胨、3.0%~7.0%酵母提取物和0.3%~0.9%磷酸氫二鉀，pH 7.2;活化所構(gòu)建 重組枯草芽孢桿菌菌株，于37 °C、200 rpm條件下進(jìn)行搖瓶發(fā)酵。
[0022]
【附圖說(shuō)明】
[0023] 圖1為重組質(zhì)粒pMA5-RDPE的構(gòu)建流程。
[0024] 圖2為基因工程菌株B. subtilis 1A751-HR分泌表達(dá)D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶 的SDS-PAGE圖譜。1A751為負(fù)對(duì)照；1A751C為將pMA5空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化1A751得到的菌株，也作為負(fù) 對(duì)照；1A751-HR為將pMA5-RDPE轉(zhuǎn)化1A751得到的菌株。Marker表示蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。箭頭 所指示的條帶為D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶蛋白。
[0025] 圖3為證明RDPE并非通過(guò)Sec途徑和Tat途徑而分泌到胞外。A:RDPE在Sec信號(hào)肽 的引導(dǎo)下的表達(dá)情