一種高生長速率的隱甲藻突變株的構(gòu)建方法
【技術(shù)領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種高生長速率的隱甲藻突變株的構(gòu)建方法，特別是一種高生長速率的產(chǎn)二十二碳六烯酸(DHA)隱甲藻突變體的構(gòu)建方法，具體是構(gòu)建具有高生長速率的隱甲藻基因刪除突變株的方法，屬于工業(yè)微生物領域，
【背景技術(shù)】
[0002]二十二碳六稀酸DHA(docosahexaenoic acid)是n_3系多不飽和脂肪酸(n_3polyunsaturated fatty acid，n_3PUFA)的一種。其含有6個不飽和鍵的特殊結(jié)構(gòu)決定了它對人類健康有著特殊的作用和影響。人們對DHA的研究備受重視的另一個原因是發(fā)現(xiàn)DHA與生命現(xiàn)象密切相關(guān)，其在大腦的結(jié)構(gòu)膜和視網(wǎng)膜中其中決定性的作用。
[0003]截止目前為止，深海魚油一直是市售的DHA的主要來源。但這一主要來源存在諸多缺點，比如海洋污染造成的對魚油安全性的擔憂，魚油質(zhì)量會隨著魚的種類、捕撈季節(jié)和地點的不同而不同，含EPA、易受環(huán)境污染、純化成本高，魚油的特殊氣味也限制了魚油來源的DHA作為一種食品添加劑的應用。尤其是考慮到DHA的主要消費者是懷孕婦女和年幼的孩子，其可能的不利影響更令人擔憂;此外，世界漁業(yè)資源的逐年萎縮對DHA的可持續(xù)性供應的影響也值得考慮。
[0004]利用隱甲藻(Crypthecodinium cohnii)發(fā)酵生產(chǎn)DHA，與傳統(tǒng)魚油來源相比，具有一系列優(yōu)點，如發(fā)酵周期短，培養(yǎng)方式簡單，微生物生長快，易于大規(guī)模培養(yǎng);多不飽和脂肪酸含量高，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，氧化穩(wěn)定性較好，不飽和脂肪酸成分單一，不含EPA或EPA含量低，易于分離純化；同時克服了傳統(tǒng)的從魚油中獲取DHA受原料、氣候、產(chǎn)地、生產(chǎn)周期等諸多限制因素的影響。因此微生物發(fā)酵生產(chǎn)DHA可替代魚油來源的DHA，具有廣泛的應用前景。
[0005]異養(yǎng)微藻隱甲藻因其能在體內(nèi)大量積累油脂(其中DHA的含量達到40%_50%)而受到研究人員的特別關(guān)注。然而有關(guān)隱甲藻基因工程相關(guān)的研究工作一直處于延至狀態(tài)，究其原因主要是隱甲藻細胞基因轉(zhuǎn)化體系和突變體構(gòu)建技術(shù)一直沒有突破性進展。因此，研究人員很難從基因?qū)用嫒媪私怆[甲藻油脂積累的代謝過程，這也進一步阻礙了人們通過基因工程技術(shù)手段修飾隱甲藻底盤細胞進一步提高其在發(fā)酵領域的應用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種隱甲藻突變體的構(gòu)建方法。
[0007]本發(fā)明一種高生長速率的隱甲藻突變株的構(gòu)建方法是通過下列方式完成，其包含如下步驟:
[0008]I)隱甲藻光合作用相關(guān)基因核酮糖I，5_二磷酸羧化酶/加氧酶Rubisco的克隆:
[0009]采用隱甲藻的Rubisco序列(EB086308.1)設計上游引物和下游引物，以隱甲藻的cDNA為模板進行PCR，純化目的片段，連入pTZ57R/T載體(Thermo Fisher Scientif ic)并測序;
[0010]2)用于同源雙交換整合的基因片段的構(gòu)建:
[0011]①隱甲藻Rubisco基因上游片段的擴增:
[0012]以隱甲藻基因組為模板，Rubisco基因上游片段的上游引物、下游引物進行PCIU^PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)DNA純化試劑盒純化，獲得隱甲藻Rubisco基因的上游片段；
[0013]②隱甲藻Rubisco基因下游片段的擴增:
[0014]以隱甲藻基因組為模板，Rubisco基因下游片段的上游引物、下游引物進行PCIU^PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)DNA純化試劑盒純化，獲得隱甲藻Rubisco基因的上游片段；
[0015]③潮霉素抗性基因片段的擴增:
[0016]以pCAMBIA1301植物表達載體為模板，hpt上下游引物進行PCR，將PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)DNA純化試劑盒純化，獲得潮霉素抗性基因片段；
[0017]④用于同源雙交換刪除Rubisco基因的DNA片段的構(gòu)建:
[0018]以隱甲藻Rubisco基因上游片段、隱甲藻Rubisco基因下游片段、以及含有hpt基因的DNA片段模板，進行融合PCR，將PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)DNA純化試劑盒純化，獲得目的片段。
[0019]3)Rubisc0基因的的刪除和突變株的構(gòu)建:
[0020]①隱甲藻感受態(tài)細胞的制備:
[0021 ] 取隱甲藻懸浮培養(yǎng)48h的細胞10mL，4°C，3500rpm離心5min，棄上清，加入ImL 25mMDTT溶液，30°C水浴15min，離心5min，棄上清，1mL IM山梨糖醇(sorbitol)清洗細胞三次，ImL山梨糖醇重懸細胞備用；
[0022]②隱甲藻感受態(tài)細胞的轉(zhuǎn)化:
[0023]在無菌條件下取200yL隱甲藻感受態(tài)細胞置于2mm電極杯中，加入IyL鮭魚精DNA和2yg目的片段混勻，冰浴5min，電擊轉(zhuǎn)化條件為2.0kV，電阻200 Ω，電容25yF，電擊之后冰浴5min，加入2mL新鮮液體C9N2培養(yǎng)基，25°C，180rpm震蕩復蘇48h，取50yL細胞懸浮液均勻圖涂布在含有40mg/L潮霉素B的固體C9N2培養(yǎng)基平板上，倒置培養(yǎng)2周，將平板上長出的單克隆細胞挑出，重新在潮霉素B的抗性平板上劃線，進行轉(zhuǎn)化子的復篩，待長出單克隆細胞，轉(zhuǎn)接液體培養(yǎng)，并進行突變體鑒定；
[0024]4)刪除突變體的分子生物學鑒定:
[0025]分別提取野生型和突變株隱甲藻細胞的基因組，以hpt基因上下游引物進行PCR，將PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳；
[0026]5)刪除突變體的生長特性分析:
[0027]所得的隱甲藻突變株M1，M6，M7在C27N7.5的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，搖床設置參數(shù)為轉(zhuǎn)速180rpm，溫度25°C;
[0028]步驟為:接種時取0D49Qr?為0.8的新鮮細胞5mL加入20mL培養(yǎng)基中，每組做三個平行樣，用UV-1750分光光度計測定波長為490nm下的吸光值，每12h測量一次，繪制柱狀圖；可以觀察到在液體培養(yǎng)基C27N7.5中，突變株的生長速率比野生株要快。
[0029]步驟2中④所述獲得目的片段是指上游片段、潮霉素B抗性片段、下游片段的一個完整融合PCR產(chǎn)物。
[0030]步驟2中②所述新鮮液體C9N2培養(yǎng)基是由葡萄糖9g、酵母浸粉2g、海鹽25g，加水至IL而成。
[0031]步驟2中②所述含有40mg/L潮霉素B的固體C9N2培養(yǎng)基是由葡萄糖9g、酵母浸粉2g、海鹽25g、瓊脂粉15g，加水至IL而成。
[0032]步驟5中所述C27N7.5液體培養(yǎng)基是由葡萄糖27g、酵母浸粉7.5g、海鹽25g，加水至IL而成。
[0033]所述的菌種為隱甲藻屬。
[0034]發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn):在異養(yǎng)條件下發(fā)酵隱甲藻產(chǎn)DHA的過程中，細胞中編碼光合作用重要酶Rubi SC0的基因依然得到轉(zhuǎn)錄表達。這就意味中細胞在代謝過程中會分散能量和營養(yǎng)去合成這些與生長和油脂積累不相關(guān)的蛋白，從而降低了細胞中能量和營養(yǎng)的使用效率，降低了生長速率。Rubisco蛋白是一類豐度很大的蛋白，占據(jù)中細胞的很大一部分空間，因此從細胞內(nèi)空間使用率的角度考慮，異養(yǎng)發(fā)酵隱甲藻時，如果Rubisco基因高效表達可能不利于細胞內(nèi)油脂的積累。
[0035]有益效果:利用本發(fā)明方法，可以實現(xiàn)對隱甲藻細胞中基因的定點快速敲除，為利用基因工程技術(shù)手段修飾隱甲藻發(fā)酵底盤細胞提供了技術(shù)支持，也為人們研究隱甲藻油脂積累機理提供了可能性。
【附圖說明】
[0036]圖1隱甲藻ATCC 30556Rubisco基因突變體構(gòu)建示意圖。
[0037]圖2轉(zhuǎn)化株的PCR鑒定圖，其中，1、2泳道為野生型；3、4泳道為突變株Ml;5、6泳道為突變株M6 ； 7、8為突變株M7。
[0038]圖3抗潮霉素B的Rubisco基因突變株和野生株在潮霉素B抗性平板上生長狀況的對照圖。
[0039]圖4野生型和Rubisco基因突變株的生長速率對比圖，其中，培養(yǎng)基為:葡萄糖27g，酵母浸粉7.5g，海鹽25g，加水至1L。培養(yǎng)至84小時，野生型和突變體細胞的生長達均達到最大值，其中突變體比野生型平均增長了 15%。利用T檢驗進行顯著性分析以證明其可信度，P值〈0.05的被認為可信。
【具體實施方式】
[0040]下面的實施例是為了使本領域的技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明但并不用于限制本發(fā)明。
[0041 ]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明:
[0042]本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下:
[0043]I)隱甲藻光合作用相關(guān)基因核酮糖I，5_二磷酸羧化酶/加氧酶Rubisco基因的克隆:
[0044]根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫報道的有關(guān)隱甲藻的Rubisco基因序列(EB086308.1)設計上、下游引物，以隱甲藻的cDNA為模板進行PCR，純化目的片段，連入pTZ57R/T載體(ThermoFisher Scientific)并測序;
[0045]2)用于同源雙交換整合的基因片段的構(gòu)建:
[0046]①隱甲藻Rubisco基因上游片段的擴增:
[0047]以隱甲藻基因組為模板，Rubisco基因上游片段的上、下游引物進行PCR，將PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)DNA純化試劑盒純化，獲得隱甲藻Rubisco基因的上游片段；
[0048]②隱甲藻Rubisco基因下游片段的擴增:
[0049]以隱甲藻基因組為模板，RubiSC0基因下游片段的上、下游引物進行PCR，將PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)DNA純化試劑盒純化，獲得隱甲藻Rubisco基因的上游片段；
[0050]③潮霉素抗性基因片段的擴增:
[0051 ]以pCAMBIA1301植物表達載體為模板，hpt基因上下游引物進行PCR，將PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)DNA純化試劑盒純化，獲得潮霉素抗性基因片段；
[0052]④用于同源雙交換刪除Rubisco基因的DNA片段的構(gòu)建:
[0053]以隱甲藻Rubisco基因上游片段、隱甲藻Rubisco基因下游片段、以及含有hpt基因的DNA片段模板，進行融合PCR，將PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)DNA純化試劑盒純化，獲得目的片段(上游片段、潮霉素B抗性片段、下游片段的一個完整融合PCR產(chǎn)物)；
[0054]3)Rubisc0基因的的刪除和突變株的構(gòu)建:
[0055]①隱甲藻感受態(tài)細胞的制備:
[0056]取隱甲藻懸浮培養(yǎng)48h的細胞1mL，4°C，3500rpm離心5min，棄上清，加入ImL 25mMDTT溶液，30°C水浴15min，離心5min，棄上清，1mL IM山梨糖醇(sorbitol)清洗細胞三次，ImL山梨糖醇重懸細胞備用；
[0057]②隱甲藻感受態(tài)細胞的轉(zhuǎn)化:
[°°58] 在無菌條件下去200yL隱甲藻感受態(tài)細胞至于2mm電極杯中，加入IyL鮭魚精DNA和2yg目的片段混勻，冰浴5min，電擊轉(zhuǎn)化條件為2.0kV，電阻200 Ω，電容25yF，電擊之后冰浴5min，加入2mL新鮮液體C9N2培養(yǎng)基25°C，180rpm震蕩復蘇48h，取50yL細胞懸浮液均勻圖涂布在含有40mg/L潮霉素B的固體C9N2培養(yǎng)基(葡萄糖9g，酵母浸粉2g，海鹽25g，瓊脂粉15g，加水至1L)平板上，倒置培養(yǎng)2周，將平板上長出的單克隆細胞挑出，重新在潮霉素B的抗性平板上劃線，進行轉(zhuǎn)化子的復篩，待長出單克隆細胞，轉(zhuǎn)接液體培養(yǎng)，并進行突變體鑒定；
[0059]4)刪除突變體的分子生物學鑒定:
[0060]分別提取野生型和突變株隱甲藻細胞的基因組，以hpt基因上下游引物進行PCR，將PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳；
[0061 ] 5)刪除突變體的生長特性分析:
[0062]所得的隱