一種利用亮氨酸脫氫酶偶聯(lián)葡萄糖脫氫酶制備l-叔亮氨酸的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明涉及一種利用亮氨酸脫氫酶偶聯(lián)葡萄糖脫氫酶制備L-叔亮氨酸的方法，屬 于酶工程和手性醫(yī)藥中間體制備技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 光學(xué)純L-叔亮氨酸，所含的叔丁基團(tuán)不僅具有空間位阻效應(yīng)還具有較強(qiáng)的疏水 性，從而被廣泛用作不對稱催化合成的模板。同時其作為一種非自然界的氨基酸，也常常應(yīng) 用于藥物活性肽當(dāng)中。有研究報道了L-叔亮氨酸用于抗腫瘤藥物試劑，抗艾滋病蛋白酶抑 制劑等藥物。正是由于L-叔亮氨酸的廣泛應(yīng)用，大量的合成方法被開發(fā)報道。其中主要包括 化學(xué)拆分法、化學(xué)不對稱合成法、酶拆分法，以及酶還原氨基化合成法(Bo_arius et al.， 1995)。由于近年人們環(huán)保意識的增強(qiáng)，具有反應(yīng)條件苛刻，反應(yīng)流程復(fù)雜，反應(yīng)效率低的化 學(xué)合成方法逐漸被生物合成法代替。在酶拆分合成的方法中，主要用到的一些酶包括青霉 素?；福久?，蛋白酶等（Abderhalden，F(xiàn)aust，&Haase，1934; Agosta et al ·，2006 ; Turner，Winterman，McCague，Parratt，&Taylor, 1995)。由于酶拆分方法存在著操作步驟繁 瑣以及理論產(chǎn)率只有50%的原因，一直沒有相關(guān)方法工業(yè)應(yīng)用的報道。
[0003] 酶還原氨基合成方法，具有操作簡單以及理論產(chǎn)率100%的特點。目前主要用到的 酶包括兩種，分別是側(cè)鏈氨基轉(zhuǎn)移酶和亮氨酸脫氫酶。Hong等報道了利用側(cè)鏈氨基轉(zhuǎn)移酶 合成L-叔亮氨酸，轉(zhuǎn)化率大于90%，但是催化的底物濃度過低達(dá)不到工業(yè)要求(Hong，Cha， ￥皿，&燈111，2010)。另外一種利用亮氨酸脫氫酶合成1^-叔亮氨酸在90年代由0叫11^ &(德國） 公司開發(fā)，并應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)。該方法運用酶膜反應(yīng)器，將亮氨酸脫氫酶和甲酸脫氫酶固定 在酶膜上，其中甲酸脫氫酶能夠催化NAD+生成NADH，實現(xiàn)輔酶的再生，減少輔酶的用量 (Liese，Seelbach，&Wandrey，2006)。亮氨酸脫氫酶催化三甲基丙酮酸合成L-叔亮氨酸被認(rèn) 為是最有工業(yè)前景的合成路徑。
[0004] 近些年來關(guān)于亮氨酸脫氫酶合成路徑的專利報道包括中國專利201110202325.4， 201210508084.0，201410695848.0，201310044292.4等。這些合成路徑都存在以下問題：1. 反應(yīng)需要外加輔酶，而輔酶價格昂貴，經(jīng)濟(jì)性差，如果能夠在合成工程中不加入輔酶的話， 將會大幅度減少工業(yè)生產(chǎn)過程的成本;2.甲酸脫氫酶活性低，在不對稱轉(zhuǎn)化過程中需要添 加大量的甲酸脫氫酶，才能夠充分發(fā)揮亮氨酸脫氫酶催化合成效果，增加了酶投入的成本； 3.反應(yīng)效率較低，正是由于反應(yīng)過程中用到的活性較低的甲酸脫氫酶，影響輔酶轉(zhuǎn)化效率， 增加完全轉(zhuǎn)化底物所需要的反應(yīng)時間，使得反應(yīng)效率較低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了克服上述問題，本發(fā)明利用共表達(dá)亮氨酸脫氫酶和葡萄糖脫氫酶菌株的破碎 粗酶液作為催化劑，進(jìn)行催化三甲基丙酮酸生產(chǎn)L-叔亮氨酸。本發(fā)明用到的葡萄糖脫氫酶 相對甲酸脫氫酶具有更高的酶活，從而提高輔酶利用效率。采用粗酶液的反應(yīng)形式能夠忽 略底物對于菌體細(xì)胞的抑制，提高底物濃度。通過在菌體培養(yǎng)過程中外加煙酸，提高胞內(nèi)輔 酶濃度，而實現(xiàn)反應(yīng)中零輔酶添加。最終，實現(xiàn)了利用亮氨酸脫氫酶偶聯(lián)葡萄糖脫氫酶來高 效制備L-叔亮氨酸。
[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種制備L-叔亮氨酸的方法，是在含有葡萄糖、底物三甲基 丙酮酸反應(yīng)體系中添加共表達(dá)亮氨酸脫氫酶和葡萄糖脫氫酶的重組菌的細(xì)胞破碎粗酶液， 攪拌反應(yīng)。
[0007] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述方法中底物三甲基丙酮酸濃度0.5-1.2M，葡萄 糖濃度是底物濃度的1.0-1.3倍。
[0008] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述反應(yīng)體系的溫度控制在20-35°C，pH控制在7.5-9.0。優(yōu)選溫度為30 °C，pH為8.5。
[0009] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述pH是通過氨水進(jìn)行控制。
[0010] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述反應(yīng)的時間為1-2.5小時。優(yōu)選反應(yīng)時間為 1.5h〇
[0011] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述反應(yīng)體系中每L含有20-60g(濕重）重組菌的細(xì) 胞破碎液，優(yōu)選30g/L。
[0012] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述攪拌的轉(zhuǎn)速為100_300r/min，優(yōu)選為200r/min。
[0013] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述底物三甲基丙酮酸濃度1M，葡萄糖濃度是1.2M， 粗酶液是30g/L(濕重)細(xì)胞得到的，反應(yīng)溫度是30 °C，pH是8.5，時間為1.5h。
[0014] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述亮氨酸脫氫酶和葡萄糖脫氫酶分別來源于 Bacillus cereus和Bacillus sp〇
[0015] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述粗酶液的制備：（1)構(gòu)建共表達(dá)氨基酸序列如 SEQ ID NO. 1的亮氨酸脫氫酶和氨基酸序列如SEQ ID N0.2的葡萄糖脫氫酶的重組菌；（2) 對重組菌進(jìn)行培養(yǎng)，誘導(dǎo)菌株表達(dá)亮氨酸脫氫酶和葡萄糖脫氫酶，得到發(fā)酵液；（3)將發(fā)酵 液離心取細(xì)胞、洗滌，然后超聲破碎，即得粗酶液。
[0016] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述步驟（1)具體是:在葡萄糖脫氫酶GDH和亮氨酸 脫氫酶LDH之間加入SD-AS序列得到基因⑶H-SD-AS-LDH，然后連接到pET28a質(zhì)粒上，再轉(zhuǎn)化 到大腸桿菌BL21宿主中，得到重組菌。
[0017] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述SD-AS序列為GGAGATATACC(SED ID從).3所示）。
[0018] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述步驟(2)中重組菌進(jìn)行培養(yǎng)所使用的培養(yǎng)基中 添加有輔酶合成路徑中的前體物質(zhì)以提高菌體內(nèi)的輔酶濃度。當(dāng)添加有前體物質(zhì)時，用于 轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-叔亮氨酸時，細(xì)胞添加量可以減少至20-30g/L(濕重）；不添加前體物質(zhì)時，細(xì)胞 添加量提高至40g/L以上，反應(yīng)過程不需要添加輔酶、轉(zhuǎn)化率高。
[0019] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述前體物質(zhì)是煙酸、煙酰胺、L-色氨酸或L-天冬氨 酸中的任意一種或者多種;優(yōu)選地，所述前體物質(zhì)是煙酸。
[0020] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述步驟(2)的培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基(蛋白胨10g/L，酵 母提取物5g/L，NaCl 10g/L，pH 7.0，其余為水，使用前加入硫酸卡那霉素50yg/mL);所述培 養(yǎng)是在37 °C、200r/min培養(yǎng)至菌體0D6QQ達(dá)到0.6-2.0，然后加入終濃度為0.1 mM的IPTG于在 18°C 培養(yǎng) 2-24h;
[0021] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述步驟(2)的培養(yǎng)基為自誘導(dǎo)培養(yǎng)基(無水葡萄糖 0.5g/L，甘油5g/L，KH2P〇4 6.8g/L，MgS〇4 0.48g/L，Na2HP〇4 7.1g/L，Na2S〇4 0.71g/L，NH4Cl 2.67g/L，蛋白粉lOg/L，酵母粉5g/L;誘導(dǎo)物a-乳糖l〇g/L，pH 7.60，以去離子水配置，使用 前加入硫酸卡那霉素50yg/mL)，所述培養(yǎng)是在30-37°C、200r/min下培養(yǎng)時間為24-48h。
[0022] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述方法具體是：（1)在葡萄糖脫氫酶GDH和亮氨酸 脫氫酶LDH之間加入序列如SEQ ID N0.3所示的SD-AS序列得到基因⑶H-SD-AS-LDH，然后連 接到pET28a質(zhì)粒上，再轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21宿主中，得到重組菌；（2)將重組菌在含有l(wèi)g/L 煙酸的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并誘導(dǎo)菌株表達(dá)亮氨酸脫氫酶和葡萄糖脫氫酶，培養(yǎng)后取菌體細(xì)胞、 洗滌；（3)在反應(yīng)體系中，添加底物三甲基丙酮酸濃度1M，葡萄糖濃度是1.2M，30g/L細(xì)胞的 粗酶液，反應(yīng)溫度是30°C，用氨水控制pH 8.5，反應(yīng)1.5h。
[0023] 有益效果
[0024] 1、本發(fā)明利用的重組菌包含亮氨酸脫氫酶、葡萄糖脫氫酶和輔酶，在催化三甲基 丙酮酸合成L-叔亮氨酸的過程中，有效的利用菌體自身所含有的輔酶實現(xiàn)輔酶循環(huán)再生， 在催化反應(yīng)的過程中不需要額外加入輔酶，實現(xiàn)了輔酶的零添加，節(jié)省輔酶的成本。
[0025] 2、本發(fā)明在單批次反應(yīng)中，底物濃度達(dá)到130g/L進(jìn)行催化反應(yīng)(為報道的單批次 最高底物濃度），轉(zhuǎn)化率達(dá)到99%以上，反應(yīng)時間縮短到1.5h以內(nèi)，時空產(chǎn)率達(dá)到2096gL一1d -1 〇
[0026] 3、本發(fā)明采用單一重組菌的粗酶液進(jìn)行催化反應(yīng)，具有催化劑制備過程簡單，催 化劑使用量少，催化效率高的特點，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
【附圖說明】
[0027]圖1為本發(fā)明反應(yīng)過程示意圖。
【具體實施方式】
[0028] 底物的檢測條件為：SB-Aq Column(4.6*150mm，5um)，流速lml/min，紫外檢測器 210nm，流動相為20mM磷酸鉀/乙腈溶液(99.5:0.5v/v，pH2.0)，進(jìn)樣量5ul。
[0029] 產(chǎn)物的檢測條件為:0180〇1111]111(4.6*25〇1]1111，511111)，利用0?4衍生化，流速11111/111；[11， 紫外檢測器338nm，流動相為50mM NaAc/乙腈溶液(80:20v/v，pH7.2)，進(jìn)樣量10ul。
[0030] 實施例1:構(gòu)建共表達(dá)亮氨酸脫氫酶和葡萄糖脫氫酶的大腸桿菌重組菌株
[0031] 利用NCBI數(shù)據(jù)庫中的基因序列設(shè)計引物，分別調(diào)取來源于Bacillus cereus和 Bacillus sp的亮氨酸脫氫酶和葡萄糖脫氫酶兩種酶基因，利用限制性內(nèi)切酶Xhol和Nhel 對目的基因與表達(dá)質(zhì)粒pET28a進(jìn)行雙酶切，目的基因與載體連接之后獲得重組質(zhì)粒 pET28a-LDH和pET28a-GDH。再從兩種基因的表達(dá)質(zhì)粒出發(fā)，利用重疊延伸PCR技術(shù)在，兩個 基因之間加入SD-AS序列(GGAGATATACC)。設(shè)計包含SD-AS序列的引物，兩輪PCR之后獲得基 因⑶H-SD-AS-LDH，將該基因連接到表達(dá)載體pET28a上，轉(zhuǎn)入大腸桿菌宿主BL21中，獲得重 組菌E. co 1 i BL21 /pET28a-G-SD-AS-L，從而實現(xiàn)兩種酶在同一個質(zhì)粒上面串聯(lián)表達(dá)。
[0032] 實施例2: LB培養(yǎng)基誘導(dǎo)表達(dá)基因工程菌株
[0033]