一種微生物定性與定量檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別設(shè)及一種微生物定性與定量的檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 微生物無處不在，且對微生物的檢測應(yīng)用也十分廣泛，包括農(nóng)業(yè)病害鑒定與預(yù)測、 食品安全檢測和醫(yī)學(xué)病原物檢測等。
[0003] 現(xiàn)有微生物定性與定量檢測技術(shù)包括形態(tài)學(xué)計數(shù)、忍片檢測、16S rRNA測序、宏基 因組測序和實時定量PCR^olymerase化ain Reaction,聚合酶鏈式反應(yīng)）。形態(tài)學(xué)計數(shù)檢 測需要對微生物進行預(yù)培養(yǎng)，耗時長，不可培養(yǎng)微生物不可檢測，一次僅能夠檢測一種微生 物，通量低，在計數(shù)時抽樣量有限，且結(jié)果粗糖，無法對種W下的分類單元進行區(qū)分。忍片檢 測所需的待測樣品的DNA量大，需要對微生物進行預(yù)培養(yǎng)及富集處理，檢測結(jié)果不準確，且 無法做定量檢測。16S rRNA測序無法對種W下的分類單元進行區(qū)分。宏基因組測序深度有 限，對于低含量的微生物的定量檢測準確度很差。實時定量PCR-次只能檢測一種微生物， 通量低。另外，已有方法共有缺陷是，無法計算微生物定性與定量的可靠性，使得結(jié)論實用 性差。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)中微生物定性與定量檢測不準確的問題，本發(fā)明實施例提供了 一種微生物定性與定量的檢測方法。所述技術(shù)方案如下：
[000引本發(fā)明實施例提供了一種微生物定性與定量的檢測方法，所述方法包括：
[0006] 確定待測樣品中的目標微生物類群、目標微生物和非目標生物、W及不存在于所 述待測樣品中的參考微生物；
[0007] 根據(jù)所述目標微生物類群、所述目標微生物、所述參考微生物和所述非目標生物 的參考基因組序列，獲得所述目標微生物類群的特征區(qū)域、所述目標微生物的特征區(qū)域和 所述參考微生物的特征區(qū)域；
[0008] 制備擴增所述目標微生物類群的特征區(qū)域的第一多重擴增引物、擴增所述目標微 生物的特征區(qū)域的第二多重擴增引物和擴增所述參考微生物的特征區(qū)域的第=多重擴增 引物，將所述第一多重擴增引物、所述第二多重擴增引物和所述第S多重擴增引物混合得 到混合多重擴增引物；
[0009] 向所述待測樣品中加入所述參考微生物，獲得混合樣品；
[0010] 提取所述混合樣品的核酸；
[0011] 利用所述混合多重擴增引物和所述混合樣品的核酸進行擴增反應(yīng)，獲得擴增產(chǎn) 物；
[0012] 利用所述擴增產(chǎn)物進行高通量測序，獲得高通量測序片段；
[0013] 根據(jù)所述高通量測序片段，對所述目標微生物類群和所述目標微生物進行定性和 定量分析。
[0014] 具體地，所述目標微生物類群的數(shù)目含I個，且每個所述目標微生物類群包括> 0 種所述目標微生物；
[0015] 所述目標微生物為細菌、病毒、真菌、放線菌、立克次體、支原體、衣原體、螺旋體、 藻類和原生動物中的至少一種；
[0016] 所述參考微生物為細菌、病毒、真菌、放線菌、立克次體、支原體、衣原體、螺旋體、 藻類和原生動物中的至少一種。
[0017] 具體地，所述確定待測樣品中的非目標生物的方法包括:將所述非目標生物確定 為除所述目標微生物類群之外的所有生物，若能獲得所述目標微生物類群的特征區(qū)域，貝U 所述非目標生物指除所述目標微生物類群之外的所有生物;若不能獲得所述目標微生物類 群的特征區(qū)域，則所述非目標生物指所述混合樣品中，除所述目標微生物類群之外的其它 生物。
[0018] 具體地，所述目標微生物類群的特征區(qū)域為所述目標微生物類群內(nèi)的微生物的參 考基因組上的核酸序列;所述目標微生物類群的特征區(qū)域的兩側(cè)的序列在所述參考基因組 中為單一序列;所述目標微生物類群的特征區(qū)域的兩側(cè)的序列在所述目標微生物類群內(nèi)不 同微生物間保守;所述目標微生物類群的特征區(qū)域的區(qū)分度> 3;
[0019] 所述目標微生物的特征區(qū)域與所述目標微生物類群的特征區(qū)域同源;所述目標微 生物的特征區(qū)域的m2值含2，其中，m2值為所述目標微生物的特征區(qū)域與所述目標微生物類 群內(nèi)除所述目標微生物外的其它所述微生物間的差異堿基數(shù)的最小值；
[0020] 所述參考微生物的特征區(qū)域為所述參考微生物的參考基因組上的核酸序列;所述 參考微生物的特征區(qū)域的兩側(cè)的序列在所述參考微生物的參考基因組中為單一序列;所述 參考微生物的特征區(qū)域的兩側(cè)的序列在除所述參考微生物外的其它生物中不具有同源性。
[0021] 進一步地，所述區(qū)分度是指由同一所述混合多重擴增引物擴增的任一所述目標微 生物類群的特征區(qū)域與任一非特征區(qū)域間的差異堿基數(shù)的最小值，其中，所述非特征區(qū)域 是所述混合多重擴增引物W所述混合樣品的核酸為模板的擴增產(chǎn)物，且所述非特征區(qū)域不 為所述目標微生物類群的特征區(qū)域，若無所述非特征區(qū)域，則所述區(qū)分度= 3XL1/4,其中， Ll為所述目標微生物類群的特征區(qū)域的核酸序列長度。
[0022] 具體地，在提取所述混合樣品的核酸時，若所述待測樣品中核酸的含量過低，則在 提取所述混合樣品的核酸的過程中，加入所述混合多重擴增引物不能擴增的外源核酸。
[0023] 具體地，所述目標微生物類群和所述目標微生物的定性分析方法如下：
[0024] 將所述高通量測序片段與每種所述目標微生物類群的特征區(qū)域進行比對，當差異 堿基數(shù)含nl時，則比對成功，相應(yīng)的所述高通量測序片段為所述目標微生物類群的特征區(qū) 域，其中，nl為所述目標微生物類群的特征測序片段的最大容錯堿基數(shù);若比對成功的所述 目標微生物類群的特征區(qū)域含1種時，則判斷所述高通量測序片段為所述目標微生物類群 的特征測序片段；
[0025] 將所述目標微生物的特征區(qū)域與每種同源的所述目標微生物類群的特征區(qū)域進 行比對，在所述目標微生物的特征區(qū)域中提取差異堿基組成所述目標微生物的標準基因 型;在所述目標微生物類群的特征測序片段上，提取所述目標微生物的標準基因型所對應(yīng) 的堿基，組成所述目標微生物的測試基因型；若所述目標微生物的測試基因型與所述目標 微生物的標準基因型的差異堿基數(shù)含n2,其中，n2為所述目標微生物的特征測序片段的最 大容錯堿基數(shù)，則所述目標微生物的測試基因型所在的所述高通量測序片段為所述目標微 生物的特征測序片段；
[0026] 將所述參考微生物作為僅包含一個所述目標微生物的所述目標微生物類群，計算 獲得的所述目標微生物的特征測序片段，即為所述參考微生物的特征測序片段；
[0027] 若所述目標微生物類群的特征測序片段存在的概率P5含巧，則判斷所述待測樣品 中存在所述目標微生物類群，其中，a5為概率保障;若所述目標微生物類群的特征測序片段 存在的概率P5<a5，則判斷所述待測樣品中不存在所述目標微生物類群；
[0028] 若所述目標微生物的特征測序片段存在的概率P6 >曰6，則判斷所述待測樣品中存 在所述目標微生物，其中，06為概率保障;若所述目標微生物的特征測序片段存在的概率P6 如6，則判斷所述待測樣品中不存在所述目標微生物；
[0029] nl使得Pl含al且P3含03,其中，Pl為一條不是所述目標微生物類群的特征測序片 段的所述高通量測序片段被誤判為所述目標微生物類群的特征測序片段而產(chǎn)生的假陽性 的概率;P3為一條所述目標微生物類群的特征測序片段被誤判為不是所述目標微生物類群 的特征測序片段而產(chǎn)生的假陰性的概率;Ql和03為判斷闊值；
[0030] n2使得P2如2且P4如4,其中，P2為一條不是所述目標微生物的特征測序片段的 所述高通量測序片段被誤判為所述目標微生物的特征測序片段而產(chǎn)生的假陽性的概率;P4 為一條所述目標微生物的特征測序片段被誤判為不是所述目標微生物的特征測序片段而 產(chǎn)生的假陰性的概率;02和a4為判斷闊值；
[0031 ] P5 = 1-BIN0M.DIST(S1，S1，P1，F(xiàn)ALW)，P6 = 1-BIN0M.DIST(S3，S3，P2，F(xiàn)ALSE)，S1 為所有的所述目標微生物類群的特征區(qū)域的所述目標微生物類群的特征測序片段的數(shù)量 的中位數(shù);S3為所有的所述目標微生物的特征區(qū)域的所述目標微生物的特征測序片段的數(shù) 量的中位數(shù)，F(xiàn)ALSE為參數(shù)值;BINOM. DIST函數(shù)返回一元二項式分布的概率。
[0032] 進一步地，所述目標微生物類群和所述目標微生物的定量分析方法如下：
[0033] 所述目標微生物類群的量Ml =Mr X S1/S2，所述目標微生物類群的量的置信區(qū)間 為[Ml 1，M12]，其中，Mr為加入所述待測樣品中的所述參考微生物的量;S2為所有的所述參 考微生物的特征區(qū)域的所述參考微生物的特征測序片段的數(shù)量的中位數(shù);Mll和M12分別為 Ml值的置信區(qū)間的下限與上限；
[0034] 所述目標微生物的量M2 = M1XS3パ1，所述目標微生物的量的置信區(qū)間為[M21， M22]，M21和M22分別為M2值的置信區(qū)間的下限與上限；
[0035] Ml 1 =Ml X (1-S4/S1) ,M12=M1 X (1+S5/S1) ,M21 =WZ X (1-S6/S3) ,122= M2 X (1 + S7/S3);其中，S4為假陽性的所述目標微生物類群的特征測序片段的數(shù)量且S4 = 0?口8抑01(115^1，〇9)，其中，115為計算51的所述目標微生物類群的特征區(qū)域的所述多重擴 增引物所擴增的所述非特征區(qū)域的所述高通量測序片段的數(shù)量;S5為假陰性的所述目標微 生物類群的特征測序片段的數(shù)量且S5 = CRITBIN0M(Sl，P3，a9)，其中，a9為概率保障；S6為 假陽性的所述目標微生物的特征測序片段的數(shù)量且S6 = CRITBINOM(Sl，P2，al〇)，S7為假陰 性的所述目標微生物的特征測序片段的數(shù)量且S7 = CR口BIN0M(S3，P4，a 10)，其中，a 10為概 率保障;CR 口 BINOM函數(shù)返回使累積二項式分布大于等于臨界值的最小值。
[0036] 進一步地，Pl = BIN0M.DIST(nl，ml，l-E，?UE)，P2 = BIN0M.DIST(n2，m2，l-E, T 抓 6)，口3 = 1-8^(11.0151'(111，1^，￡^抓￡)，口4=1-8^(11.0151'(112，1^2，￡^抓￡)，其中，1111為 所述區(qū)分度;所述m2為所述目標微生物的特征區(qū)域與所述目標微生物類群的其它所述微生 物間差異堿基的最小值;Ll為所述目標微生物類群的特征區(qū)域的長度;L2為所述目標微生 物的標準基因型的長度;E為堿基錯誤率。
[0037] 本發(fā)明實施例提供的技術(shù)方案帶來的有益效果是:本發(fā)明提供的方法不需要對微 生物進行預(yù)培養(yǎng)與增殖，耗時短，可同時檢測多種微生物，通量高，計數(shù)時抽樣量大，檢測結(jié) 果精細，能夠?qū)Ψ诸悊卧M行區(qū)分，無需大量的DNA并避免了富集培養(yǎng)，檢測結(jié)構(gòu)無噪音且 準確，對于低含量微生物的定量準確度高，且對于微生物定性和定量的檢測結(jié)果準確、分辨 率高、靈敏度高、有概率保障，檢測過程簡單、快速且流程規(guī)范。
【具體實施方式】
[0038] 為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚，下面將對本發(fā)明實施方式作進一 步地詳細描述。本發(fā)明中未標注說明的試劑均為常用市售試劑，在大多數(shù)生物技術(shù)公司均 可購買到且效果幾乎無差別。
[0039] 實施例一、水稻白葉枯菌的鑒定
[0040] 本發(fā)明實施例一從中國科學(xué)院海南陵水實驗基地中，取自然感染了白葉枯病的水 稻葉片作為待測樣品，通過本發(fā)明實施例提供的方法對所取的水稻葉片中的白葉枯菌進行 定性、定量檢測。
[0041 ]步驟一、確定待測樣品中的目標微生物類群、目標微生物