[0054] 4)預(yù)測(cè)白菜霜霉病抗性中的應(yīng)用。
[005引上述方法中，所述等位基因特異性PCR的模板為待測(cè)白菜的基因組DNA。
[0056] 本發(fā)明根據(jù)上述SNP位點(diǎn)還開(kāi)發(fā)了一種白菜的育種方法，包括檢測(cè)待測(cè)白菜基因 組A0817684339T/C位點(diǎn)的多態(tài)性或基因型，選擇基因組A0817684339T/C位點(diǎn)的多態(tài)性或基 因型為CC的待測(cè)白菜作為親本進(jìn)行育種。
[0057] 上述方法中，所述TT是A081 7684339T/C位點(diǎn)為T(mén)的純合型，所述CC是 A0817684339T/C位點(diǎn)為C的純合型，所述TC是A0817684339T/C位點(diǎn)為T(mén)和C的雜合型。
[0058] 本發(fā)明根據(jù)上述SNP位點(diǎn)還開(kāi)發(fā)了一組鑒別或輔助鑒別白菜霜霉病抗性的引物 組，由引物1、引物2和引物3組成。
[0059] 所述引物1為如下al)或曰2):
[0060] al)序列1所示的單鏈DNA分子。
[0061] a2)將al)限定的單鏈DNA分子進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)堿基的缺失、插入和/或改變得到 的、與al)限定的單鏈DNA分子具有相同功能的單鏈DNA分子。
[0062] 所述引物2為如下bl)或b2):
[0063] bl)序列2所示的單鏈DNA分子。
[0064] b2)將bl)限定的單鏈DNA分子進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)堿基的缺失、插入和/或改變得到 的、與b 1)限定的單鏈DNA分子具有相同功能的單鏈DNA分子。
[006引所述引物3為如下Cl)或c2):
[0066] cl)序列3所示的單鏈DNA分子。
[0067] c2)將Cl)限定的單鏈DNA分子進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)堿基的缺失、插入和/或改變得到 的、與C1)限定的單鏈DNA分子具有相同功能的單鏈DNA分子。
[0068] 上述一個(gè)或幾個(gè)堿基的缺失、插入和/或改變?yōu)樗鰡捂淒NA分子3 '末端堿基之外 一個(gè)或幾個(gè)堿基的缺失、插入和/或改變。
[0069] 上述引物組中，所述引物1、所述引物2和所述引物3的摩爾比為12:12:30。
[0070] 本發(fā)明根據(jù)上述SNP位點(diǎn)還開(kāi)發(fā)了含有上述引物組的鑒別或輔助鑒別白菜霜霉病 抗性的試劑或試劑盒。
[0071] 實(shí)驗(yàn)證明，利用本發(fā)明所提供的SNP位點(diǎn)與其對(duì)應(yīng)的引物對(duì)白菜霜霉病抗性的鑒 定結(jié)果與利用常規(guī)檢測(cè)方法的鑒定結(jié)果完全一致。表明，可利用本發(fā)明所提供的SNP位點(diǎn)與 其對(duì)應(yīng)的引物對(duì)白菜霜霉病抗性進(jìn)行鑒定，也可用于選育白菜霜霉病抗病品種。本發(fā)明的 優(yōu)點(diǎn)是分子標(biāo)記(SNP位點(diǎn)）為共顯性，鑒定結(jié)果準(zhǔn)確可靠、省時(shí)省力、降低了勞動(dòng)成本，本發(fā) 明的應(yīng)用將對(duì)加快大白菜抗霜霉病育種進(jìn)程起到重要作用。
【附圖說(shuō)明】
[0072] 圖1為A0817684339T/C位點(diǎn)在234份DH自交型材料中的基因分型鑒定圖。
【具體實(shí)施方式】
[0073] 下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實(shí)施例僅為了闡 明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為 常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0074] 大白菜('91-112" (Genetic mapping and localization of a major QTL for seedling resistance to downy mildew in Chinese cabbage(Brassica rapa ssp.pekinensis)，Mol化eeding(2009)23:573-590.)公眾可從北京市農(nóng)林科學(xué)院獲得，該 生物材料只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實(shí)驗(yàn)所用，不可作為其它用途使用。
[0075] 大白菜"T12-19" (Genetic mapping and localization of a major QTL for seedling resistance to downy mildew in Chinese cabbage(Brassica rapa ssp.pekinensis)，Mol化eeding(2009)23:573-590.)公眾可從北京市農(nóng)林科學(xué)院獲得，該 生物材料只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實(shí)驗(yàn)所用，不可作為其它用途使用。
[0076] 實(shí)施例1、分子標(biāo)記的獲得
[OOW]為了更好更快地篩選獲得抗霜霉病資源，促進(jìn)分子標(biāo)記輔助選擇育種實(shí)踐的進(jìn) 行，通過(guò)對(duì)高感霜霉病株系91-112、高抗霜霉病株系T12-19的基因組重測(cè)序數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)， 在AS染色體第17684339位的堿基有一個(gè)T/C突變的SNP位點(diǎn)（序列表序列4中第301位核巧 酸），該SNP位點(diǎn)命名為A0817684339T/C位點(diǎn)。根據(jù)A0817684339T/C位點(diǎn)，設(shè)計(jì)如下可用于 KASP技術(shù)的與目的基因緊密連鎖的特異引物作為分子標(biāo)記：上游引物A0817684339-FF、上 游引物A0817684339-FV和下游引物A0817684339-R。
[007 引 上述 40817684339斗尸、40817684339-尸￥和40817684339-1?引物委托英國(guó)1^；0 化aboratory of the Government Chemist政府化學(xué)家實(shí)驗(yàn)室）有限公司獲得。 A0817684339-FF、A0817684339-FV 和 A0817684339-R 引物序列特征如下：
[0079]上游引物 A0817684339-FF:
[0081 ]上游引物 A0817684339-FV:
[0083]下游引物 A0817684339-R:
[00化]上述上游引物最后一位堿基t/c對(duì)應(yīng)A8染色體上第17684339位的SNP位點(diǎn)，即序列 表序列4中第301位核巧酸。
[0086] 實(shí)施例2、A0817684339T/C位點(diǎn)的分子標(biāo)記在鑒定的感霜霉病和抗霜霉病材料中 的應(yīng)用
[0087] 1、分子標(biāo)記鑒定的感霜霉病和抗霜霉病材料 [008引 1) DNA提取
[0089] 常規(guī)CTAB法分別提取表1中234種待測(cè)白菜材料的基因組DNA。表1中的232種待測(cè) 白菜材料是利用親本91-112和T12-19雜交獲得Fl代后，繼續(xù)利用小抱子培養(yǎng)獲得的雙單倍 體株系。
[0090] 用瓊脂糖電泳和化no化OP2100分別檢測(cè)所提取DNA的質(zhì)量，發(fā)現(xiàn)提取的基因組DNA 均達(dá)到了相關(guān)的質(zhì)量要求，即瓊脂糖電泳顯示DNA條帶單一，沒(méi)有明顯彌散;化no化OP2100 檢測(cè)A260/280介于1.8-2.0之間（DNA樣品沒(méi)有蛋白污染）；A260/230介于1.8-2.0之間（DNA 樣品鹽離子濃度低）；270nm沒(méi)有明顯的光吸收化NA樣品沒(méi)有酪污染）；用于競(jìng)爭(zhēng)性等位基因 特異性PCR技術(shù)檢測(cè)的DNA用量為4~IOng/每樣品。稀釋DNA濃度成為IOngAil備用，得到待 測(cè) DNA。
[0091] 2)基于競(jìng)爭(zhēng)性等位基因特異性PCR
[0092] 按照英國(guó)LGC(Laborato;ry of the Government Qiemist政府化學(xué)家實(shí)驗(yàn)室）有限 公司提供的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)流程，即基于競(jìng)爭(zhēng)性等位基因特異性PCR技術(shù)的實(shí)驗(yàn)流程進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，W 下試劑除特殊說(shuō)明為均為L(zhǎng)GC公司提供的配套試劑，試劑用量、用法、W及整個(gè)實(shí)驗(yàn)步驟按 照LGC公司的操作指南GenetypingAssay ,Manual F*a;rt#15004070Rev.B進(jìn)行。KASPar反應(yīng)在 384微孔板或1536微孔板(Cat. No. 04729749001 ,Roche)中進(jìn)行，反應(yīng)體系為3ul或Iul。
[0093] 具體步驟為:首先利用K-pette分液工作站在微孔板中加入待測(cè)DNA模板(4ng/山） 1.扣1，60°C烘干。然后在Kraken操作系統(tǒng)下利用Meridian加樣工作站向每個(gè)反應(yīng)孔中加入 IXMaster mix(邸S-1016-002或化t.No.邸S-1016-011，Laborato;ry of the Government 化emist)與引物預(yù)混液(實(shí)施例1的兩條上游引物和下游引物按照摩爾濃度比12:12:30混 合，各引物終濃度為IOyM) ,Mix分裝完畢立即將微孔板依次放在Kube熱封儀和化Sion激光 封膜儀上封膜。PCR反應(yīng)在高通量水浴系統(tǒng)Hy化ocy C Ier中進(jìn)行，具體程序?yàn)?4°C預(yù)變性，15 分鐘;94°C，20秒(變性)一ere-55°C，1分鐘(復(fù)性&延伸：Wtouch down程序擴(kuò)增10個(gè)循環(huán)， 每循環(huán)降低〇.6°C);94°C，20秒(變性)一55°C，60秒繼續(xù)擴(kuò)增26個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增結(jié)束后，利用 BMG P肥RAstar儀器檢測(cè)巧光信號(hào)并查看分型情況。若分型不充分，則繼續(xù)擴(kuò)增，每3個(gè)循環(huán) 查看分型情況，直至分型完全。
[0094] 結(jié)果如圖1所示，結(jié)果顯示分型效果良好，A0 8 1 7 6 8 4 3 3 9 T/ C位點(diǎn)的引物組 (A0817684339-FF、A081