r>[0160] 圖4:針對(duì)共價(jià)連接纖維素微纖絲的活性的可能性。
[0161] 圖5:在硫酸錠沉淀的木賊屬蛋白的等電點(diǎn)聚焦之后，包含=種內(nèi)轉(zhuǎn)葡糖基酶活性 (XET (斜紋條）、MXE (黑條）、CXE (白條））的分?jǐn)?shù)I-20的校正的放射性(對(duì)于MXE和XET為cpm， 對(duì)于 CXE 為 cpm/6)。
[0162] 圖6:在畢赤酵母中表達(dá)的HTG蛋白的XET、MXE和CXE活性的時(shí)間表。XE巧舌性W菱形 指示，MXE活性W正方形指示，并且CXE活性WS角形指示。X軸:時(shí)間(min);Y軸:滲入的放射 性（cpm)。
[0163] 圖7:在其中大麥混合鍵葡聚糖用作供體的測(cè)定中重組HTG的受體底物特異性。針 對(duì)潛在的受體底物(所有均W化標(biāo)記甘露己糖醇（1)、纖維己糖醇（2)、（1^4)-e-半乳己糖醇(3)、（ 1 一4) -a-半乳糖醒酸己糖醇(4)、XXLGo K 5)、GGXXXGo 1 (6)、XXXGo 1 (7)、 GXXGol(S)、麥芽己糖醇（9)、纖維素酶產(chǎn)生的MLG的屯糖和八糖（10)、（1一4)-0-木己糖醇 (11 )、地衣聚糖酶產(chǎn)生的MLG的屯糖到十糖（12 )、地衣聚糖酶產(chǎn)生的MLG的八糖（13 )、地衣聚 糖酶產(chǎn)生的MLG的屯糖（14)、W及昆布下糖醇（15)顯示了滲入百分比。木葡聚糖寡糖的縮寫 命名(XXLGo 1，GGXXXGo 1，XXXGo 1，GXXGo 1)由弗賴伊等人（1993)進(jìn)行了說明。
[0164] 圖8:核巧酸序列(A)和氨基酸序列(B)的比對(duì)，分別為SEQ ID NO 1、5和7、W及SEQ ID NO 2、6和8。
[01化]圖9:在BSA的存在或不存在下在畢赤酵母中表達(dá)的HTG蛋白的XET、MXE和CXE活性 的時(shí)間表。具有BSA的XET活性：白色正方形;沒有BSA的XET活性:黑色正方形;具有BSA的MXE 活性：白色立角形;沒有BSA的MXE活性:黑色立角形;具有BSA的CXE活性：白色圓形;沒有BSA 的CXE活性:黑色圓形。X軸:解育時(shí)間化）;Y軸:滲入的3H放射性(提供的底物的cpm/kBq)。
[0166] 圖10:W[3H]XXXGo1作為受體底物并且具有不同供體底物的HTG催化的轉(zhuǎn)糖基作 用，所述不同供體底物包括:混合鍵葡聚糖(MLGK十字形）；木葡聚糖(S角形)水溶性乙酸 纖維素(WSCA)(菱形）；普通紙(PP)(黑色正方形）；堿預(yù)處理的紙(AP)(黑色圓形）；堿預(yù)處理 的紙+牛血清白蛋白（AP+BSA)(白色圓形）、普通紙+牛血清白蛋白（PP+BSA)(白色圓形）dX 軸:解育時(shí)間化）;Y軸:滲入的3H放射性(提供的Bq/kBq)。
[0167] 圖11: W[3H]XXXGo1(黑色符號(hào)）或[3H]纖維下糖醇(GGGGol)(白色符號(hào)）作為受體 并且具有不同供體底物的轉(zhuǎn)糖基作用，運(yùn)些不同供體底物包括：堿預(yù)處理的紙+bsa(ap+ BSAK菱形；具有XXXGol的黑色菱形、具有GGGGol的白色菱形）、混合鍵葡聚糖(MLG) (S角 形;具有XXXGol的黑色S角形、具有GGGGo 1的白色S角形)和木葡聚糖（圓形;具有XXXGol的 黑色圓形、具有GGGGo 1的白色圓形）。X軸:解育時(shí)間化）；Y軸:滲入的化放射性(提供的Bq/ kBq) O
[0168] 圖12:HTG催化的轉(zhuǎn)糖基作用率，其中MLG(灰色條)或木葡聚糖（黑色條)作為供體 底物，并且不同的化-寡糖作為潛在的受體。具有XXXGol的反應(yīng)率設(shè)置在100% dA、B、和C代 表S個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)B和C利用親和柱純化的HTG。在實(shí)驗(yàn)C中，僅僅MLG用作供體。1: XXXGo1，2:GXXGo1;3:GGXXXGo1;4:XXLGo1;5:X化Go1;6:Ce114-01;7:Mane-01;8:Xy16-01; 9：MLG0-〇l A；10：MLG0-〇l B；11：MLG〇-〇1 C；12：Cell6-〇l；13：MLG〇-〇1 D；14：MLG〇-〇1 E； 15:MLG0-〇l 尸；16:1^日1114-〇1;17:6日16-〇1;18:6日146-〇1;19:]\&1116-〇1。4斗的血1；0-〇1未被單 獨(dú)鑒定，但用地衣聚糖酶(A-C)消化的來自大麥MLG的屯糖到十糖或纖維素(D-F)進(jìn)行了鑒 定。
[0169] 貫穿本申請(qǐng)，參考了 W下序列：
[0170] SEQ ID NO: 1:溪木賊HTG的核巧酸序列
[0171] 沈Q ID N0:2:由沈Q ID NO: I編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列
[0172] SEQ ID N0:3:用于在己斯德畢赤酵母中表達(dá)的HTG融合蛋白的核巧酸序列
[0173] 沈Q ID N0:4:由沈Q ID N0:3編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列
[0174] SEQ ID NO:5:木賊HTG的核巧酸序列
[01巧]沈Q ID N0:6:由沈Q ID N0:5編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列
[0176] SEQ ID NO:7:披散木賊HTG的核巧酸序列
[0177] 沈Q ID N0:8:由沈Q ID N0:7編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列 [017引運(yùn)些實(shí)例展示了本發(fā)明。
[0179] 實(shí)例1:材料和方法
[0180] 1.1 一般概述
[0181] 除非另外說明，所進(jìn)行的克隆步驟，例如像限制性切割、瓊脂糖凝膠電泳、DNA片段 的純化、連接DNA片段、細(xì)菌或酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)細(xì)菌或酵母W及重組DNA的序列分析正 如由薩姆布魯克（Sambrook) (2000)所述來進(jìn)行。使用ABI激光巧光DNA測(cè)序儀按照桑格 (Sanger)方法進(jìn)行重組DNA分子的測(cè)序。
[0182] 1.2從植物材料中提取酶
[0183] 從在CaCl2(1 OmM)、班巧酸(0.3M)和抗壞血酸（20mM)(新鮮配制為pH 5.5)中的新 鮮植物組織提取粗酶混合物。添加不溶性交聯(lián)聚乙締基化咯燒酬(Polyclar AT) (3%w/v)， 與酪類物質(zhì)復(fù)合。在食品攬拌機(jī)中用每克鮮重組織5ml的提取劑將新鮮組織均質(zhì)化。將組織 和提取劑在冰上攬拌2.化。將提取物通過兩層神奇濾布(Miracloth)過濾，并且在落地式高 速冷凍離屯、機(jī)（Sorvall Evolution RC Centrifuge)中離屯、（10min，10,OOOrpm,4°C)。收集 上清液并分裝，然后在液氮中在-80°C冷凍并保存。
[0184] 1.3Rotofor 等電聚焦（IEF)
[01化]根據(jù)制造商的手冊(cè)組裝和準(zhǔn)備伯樂等電聚焦電泳儀(Bio-Rad Rotofor Cell)。該 Rotofor由伯樂高電壓電源(BioRad化we巧ac HV)提供動(dòng)力。將兩性電解質(zhì)與水和標(biāo)記混 合物(含有藻青蛋白、血紅蛋白A和C、和細(xì)胞色素 C)或透析的蛋白質(zhì)樣品的任一者混合。根 據(jù)制造商的方法，在IOW恒功率處進(jìn)行分離，直到電壓穩(wěn)定時(shí)為止，并收集級(jí)分。使用賽多利 斯PB-IlpH計(jì)（Sartorius PB-IlpH meter)來測(cè)量運(yùn)些級(jí)分的pH。還測(cè)定了轉(zhuǎn)葡糖基酶活 性。
[0186] 1.4巧光轉(zhuǎn)糖基作用測(cè)定
[0187] 試紙的制備
[0188 ]按照弗賴伊（19 9 7)制成斑點(diǎn)印跡或試紙。用沃特曼(Wha tman) 1CHR色譜紙制成試 紙。通過浸入1.0 % XyG中、干燥、然后浸入在75 %丙酬或75 %乙醇中的扣M XXXG-SR(XXXG和 橫酷羅丹明（SR))的綴合物）制成XET試紙。另一種紙浸入1.0%MLG、干燥、然后浸入XXXG-SR，W制成MXE試紙。制作除了紙本身的不含多糖供體底物的對(duì)照紙，其包含受體底物。所有 試紙的最終受體底物濃度為約125pmol/cm 2。
[0189] 試紙測(cè)定
[0190] 將試紙切割成一定的大小，W兩種方式使用:任意酶溶液W小斑點(diǎn)的方式(斑點(diǎn)印 跡測(cè)定)施用到紙上，或者施用所述紙使其與非變性PACiE凝膠(酶譜測(cè)定)密切接觸。在兩個(gè) 密封的玻璃板之間的潮濕環(huán)境中解育W進(jìn)行測(cè)定。然后將紙?jiān)谑覝叵赂稍锊⑶以谝掖?FA: 水巧FW)1:1:1中洗涂一小時(shí)。將試紙條干燥，壓在重量下過夜，并且使用UVP Multi Doc-It 數(shù)字成像系統(tǒng)拍照。當(dāng)在254nm處的紫外光下激發(fā)時(shí)，作為巧光形式的陽性轉(zhuǎn)糖基作用是明 顯的。
[0191] 巧光斑點(diǎn)印跡測(cè)定
[0192] W斑點(diǎn)形式(9mm中屯、距，即，在96孔板形式中）將活性酶溶液[典型地在班巧酸緩 沖液中，pH 5.5,含有IOmM化Cl2]的3-山等分試樣施用到干的試紙上。
[0193] 迅速將所述紙夾在2張聚乙締或玻璃之間，W重量（電話簿)壓平并在室溫下解育 1-2地。酶斑點(diǎn)應(yīng)當(dāng)保持潮濕。為了實(shí)現(xiàn)運(yùn)一點(diǎn)，有益的是將酶溶液(或緩沖液空白）的斑點(diǎn) 布置在所述紙的整個(gè)區(qū)域上方，沒有留下邊緣。
[0194] 允許露天干燥，然后在聚乙締夾屯、盒中洗涂，所述夾屯、盒含有
[0195] ?乙醇:90% 甲酸:水化FW)1:1:1
[0196] ?或10%甲酸水溶液
[0197] 伴隨輕輕搖動(dòng)一小時(shí)。
[0198] 如果對(duì)XET或MXE產(chǎn)物可能也已形成存有任何疑問（盡管還未曾有意地添加針對(duì)運(yùn) 些活性的適當(dāng)供體底物），可能有益的是將該紙?jiān)?M化OH(伴隨輕輕搖動(dòng)，因?yàn)樵摷垥?huì)變 脆)中洗涂。
[0199] 在自來水中徹底沖洗。
[0200] 干燥。
[0201] 在UV光(254nm或310nm)或綠色激光下觀察，并記巧E反應(yīng)產(chǎn)物的澄色巧光斑點(diǎn)。
[0202] 1.5纖維素:木葡聚糖內(nèi)轉(zhuǎn)葡糖基酶(巧E)測(cè)定
[0203] 將沃特曼ICHR色譜紙（10-35mg;預(yù)處理過的*)與酶提取物或級(jí)分、[化]XXXGol (化Bq)、和巧樣酸鹽緩沖液(pH 6.3，終體積10化1)一起解育持續(xù)指定的時(shí)間，一般為0-24 小時(shí)。通過添加90%甲酸（3化1)停止反應(yīng)，然后通過重復(fù)地加水、離屯、、并去除上清液來洗 涂該紙，直到上清液不再含有放射性時(shí)為止。纖維素常常需要約六次洗涂，從而變得不含可 溶性放射性。將剩余的纖維素懸浮在0.5ml的水中，轉(zhuǎn)移到具有5ml的水可混溶的閃爍體的 閃爍瓶中，并且通過閃爍計(jì)數(shù)測(cè)定放射性。
[0204] *紙的預(yù)處理：
[0206] 1.6 非變性 PAGE
[0207] 類似于SDS PAGE制作非變性聚丙締酷胺凝膠，但有少許差異。用4.3%的丙締酷胺 連同立婚甲基)氨基甲燒(Tris)(67mM，pH 6.7，具有也口〇4)制成積層凝膠。解析凝膠濃度是 具有Tris(376mM，pH8.9)的7.5%的丙締酷胺。運(yùn)行緩沖液含有Tris(5mM)和甘氨酸 (38mM)。在6 °C在20mA進(jìn)行凝膠電泳25分鐘，然后在40mA電泳化。
[020引1.7在DMA/LiCl中的纖維素的溶出度
[0209]運(yùn)個(gè)程序根據(jù)古里亞諾夫(Gurjanov)等人(2008)進(jìn)行改良。活化（10(TC，3h)分子 篩（4A )。在篩上干燥二甲基乙酷胺(DMA)持續(xù)至少5d。將LiCl (Sg)干燥（180°C，地），并且 溶解在干DMA(100mL)中。將沃特曼ICHR紙片在水中水合化，然后在尼龍網(wǎng)上過濾。將紙片在 丙酬中洗涂，然后在丙酬中解育化。使用尼龍網(wǎng)再將紙片濾出，在DMA中洗涂，并在干DMA中 解育過夜。去除DMA并替換為DMA中的8%LiCl，使得該紙為l%(w/v)。通過在室溫下攬拌溶 解該紙。添加等體積的干DMAW降低纖維素溶液的粘度。通過蠕動(dòng)累將該溶液緩慢添加至迅 速攬拌的6M NaOH,在其中纖維素被沉淀，但預(yù)期來自所述紙的半纖維素保留在溶液中。
[0210] 實(shí)例2:作為針對(duì)M)(E的供體底物的纖維素
[0211] 在尋找具有轉(zhuǎn)葡糖基酶的酶類的過程中，尤其是MXE(MLG:木葡聚糖內(nèi)轉(zhuǎn)葡糖基 酶)和XET(木葡聚糖內(nèi)轉(zhuǎn)糖基酶)活性，使用硫酸錠沉淀和等點(diǎn)聚焦(Rotofor)部分純化的 來自溪木賊的酶顯示出發(fā)揮MXE活性和/或XET活性。在用XXXG-SR(XXXG(木葡聚糖的屯糖） 的橫酷羅丹明綴合物)處理過但是沒有添加多糖供體底物的紙條上的陰性對(duì)照中，預(yù)期沒 有指示酶活性的殘余巧光（圖1)。然而，明顯的轉(zhuǎn)葡糖基酶活性條帶反映在所有S種XET(木 葡聚糖內(nèi)轉(zhuǎn)葡糖基酶）、MXE、和對(duì)照試紙上。由于纖維素是唯一已知的存在于對(duì)照中的多 糖，研究了 e-(i^4)-葡聚糖在轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)中用作供體底物的可能性。
[0212] 用XXXG-SR浸透試紙
[0213] 首先，在略微不同的實(shí)驗(yàn)中重復(fù)觀察沒有(除了紙之外)供體底物的明顯的轉(zhuǎn)糖基 產(chǎn)物形成。將富含MXE和XET活性的部分純化的酶作為稀釋系列施用到浸透MLG(混合鍵1，3; l，4-e-d-葡聚糖）、XyG(木葡聚糖）、或沒有添加多糖和XXXG-SR的S種試紙上。將運(yùn)些紙維 持在潮濕環(huán)境中化，然后洗涂至不含XXXG-SR，并在UV光下拍照，W顯示巧光轉(zhuǎn)糖基產(chǎn)物（圖 2曰）。然后將S種紙?jiān)?M NaOH中解育W從所述紙中去除半纖維素并在此拍照（圖化）。
[0214] 在運(yùn)里實(shí)際上重復(fù)了沒有添加供體底物的紙的初步觀察，該紙單獨(dú)地可W是轉(zhuǎn)糖 基作用的底物。=種試紙都顯示出轉(zhuǎn)糖基產(chǎn)物，正如通過巧光斑點(diǎn)看出的，甚至當(dāng)將酶W16 倍稀釋在緩沖液中時(shí)也如此。半纖維素，包括MXE和XET產(chǎn)物在內(nèi)，將會(huì)在6M NaOH中被洗出。 正如預(yù)期，MXE和XET試紙條具有顯著更少的產(chǎn)物(可能沒有)保留在紙上。在NaOH洗涂之后， 對(duì)照紙保留了產(chǎn)物，盡管保留較少。纖維素和某些甘露聚糖類不溶于水性化OH中（莫雷拉 (Moreira)和菲利歐(Fi化0) ,2008)，并且很可能為供體底物的候選物。
[0215] 使用了沃特曼IC皿色譜紙。它由棉花制成，但是不能獲得關(guān)于在造紙過程中該材 料的處理信息。能夠貢獻(xiàn)轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)所需要的能量的存在最豐富的多糖毫無疑問是纖維 素。在通過TFA和崩潰酶（Dfiselase"：>(含有多糖外水解酶和內(nèi)水解酶的真菌酶制劑，所 述水解酶包括纖維素酶、果膠酶、e-木聚糖酶和e-甘露聚糖酶)水解進(jìn)行分析之后，排除了 其他多糖作為供體底物。
[0216] 總的說來，TFA和崩潰酶(Dr i Se Iase)水解表明，沃特曼1CHR主要由最可能來自纖 維素的葡萄糖組成。TFA(S氣乙酸）水解還顯示了微量的木糖。類似地，崩潰酶 (Drisekse? )消化產(chǎn)生了次于葡萄糖和纖維二糖的作為最為豐富糖的木糖。同樣，消化 未顯示微量的異樓草糖，表明XyG的不存在。包含崩潰酶3??合物的某些糖蛋白在解育過 程中自溶，從而產(chǎn)生微量的葡萄糖和甘露糖。
[0217] 纖維素:木葡聚糖內(nèi)轉(zhuǎn)葡糖基酶放射性測(cè)定
[0218] 為了測(cè)定從纖維素為供體底物的新的轉(zhuǎn)葡糖基酶活性，暫時(shí)命名為'CXE'，使用了 放射性受體[3H]XXXGo1 (還原的XXXG，Xyl3 .Glc3.葡糖醇）。
[0219] 天然纖維素作為供體
[0220] 為了確定運(yùn)種活性是否與木賊屬植物的生長(zhǎng)有關(guān)，使用植物材料作為潛在的供體 底物。首先，制備了愈傷組織培養(yǎng)細(xì)胞和成熟植物莖的酒精不溶性殘?jiān)?AIR)。在6M NaOH中 解育殘?jiān)黈去除半纖維素，其中一些也會(huì)是供體底物。測(cè)試AIR和化OH洗涂的殘?jiān)鳛闈撛?供體底物(圖3)。
[0221] 如前所示，沃特曼紙能夠作為轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)的供體底物。培養(yǎng)細(xì)胞富含XyG但缺乏 MLG(圖1 )，并且預(yù)期供應(yīng)針對(duì)XET的供體底物。富含MLG和XyG兩者的成熟芽含有針對(duì)MXE、 XET、和CXE的底物。然而，有趣的是，在NaOH中洗涂的所有樣品都比未洗涂的紙或AIR結(jié)合了 更多的受體底物。如果6M化OH去除了覆蓋纖維素微纖絲的所有半纖維素，并且如果它能降 低微纖絲的結(jié)晶度，則有可能纖維素是比任何其他底物更好的針對(duì)占優(yōu)勢(shì)的轉(zhuǎn)葡糖基酶的 底物。
[0222] 纖維素和巧E產(chǎn)物的溶解和重構(gòu)
[0223] 已經(jīng)提出半纖維素可被捕獲在纖維素微纖絲的無定形區(qū)內(nèi)（羅斯(Rose)和貝內(nèi)特 (Bennet) 1999)。運(yùn)種'捕獲的'半纖維素可被更緊密地連接至纖維素，在溫?zé)岬膲A中保持結(jié) 合在微纖絲上。有人可能會(huì)爭(zhēng)論說運(yùn)些假定的半纖維素是針對(duì)所觀察的關(guān)于紙的轉(zhuǎn)糖基作 用的真正供體底物。
[0224] 另一種方法證實(shí)，[化]XXXGol共價(jià)連接到纖維素上是為了溶解纖維素產(chǎn)物。如果 纖維素微纖絲在堿中重構(gòu)，則半纖維素將不再被捕獲在微纖絲內(nèi)并將保持可溶。
[02巧]使用二甲基乙酷胺(DMA)中的氯化裡化iCl)將纖維素溶解。在DMA中的8%LiCl溶 液溶解了CXE產(chǎn)物。將該粘稠溶液緩慢轉(zhuǎn)移到大容量的6M化OH中，在其中纖維素被重新沉 淀。從上清液中分離固體纖維素并監(jiān)測(cè)每個(gè)級(jí)分中的放射性產(chǎn)物(表1)。
[0226] 表1:巧E產(chǎn)物的重構(gòu)
[0。引將CXE產(chǎn)物(40mg，使用凝膠滲透色譜產(chǎn)生)浸泡在水中化，然后將溶劑換為丙酬。 將該紙浸泡在丙酬中化，然后換為沒有出0的DMA(在4A的西格瑪（Si卵a(bǔ))分子篩上持續(xù) 5d)，并旋轉(zhuǎn)16h。去除DM，并將CXE產(chǎn)物在具有8%(w/v化iCl的干DMA(4ml)中解育16h。然后 添加4ml的DMAW降低粘度。通過蠕動(dòng)累W3.2mlA的速率將纖維素溶液緩慢添加至攬拌中 的6M NaOH(80ml)。將所得混合物攬拌4她。移除一部分混合物并離屯、。將上清液從沉淀劑中 分離;兩者都用HOAc中和并進(jìn)行閃爍計(jì)數(shù)。報(bào)告了總上清液和總沉淀物的cpm。
[0229] 由于許多化產(chǎn)物被沉淀，纖維素可能確實(shí)是針對(duì)關(guān)于紙的轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)的的真正底 物。大部分化遵循預(yù)期的在LiCl和DMA中溶解之后的在6M化OH中的纖維素沉淀模式。雖然 在沉淀中的氣與在上清液中的氣的測(cè)量比為2.2:1，在Bq基礎(chǔ)上的運(yùn)個(gè)比率也許更高，因?yàn)?固體顆粒是W比溶液更低的效率計(jì)數(shù)的。
[0230] 保留在溶液中的放射性也許就是XXXGol的分解產(chǎn)物，或者會(huì)是附接至XXXGol的0-(1^4)-葡聚糖的短片段，其由于XGO而具有增加的溶解度。
[0231] 總而言之，在6M NaOH中重構(gòu)纖維素之后，通過DMA中的LiCl溶解的CXE產(chǎn)物發(fā)生沉 淀，表明該轉(zhuǎn)糖基產(chǎn)物不是半纖維素。
[0232] 巧E是部分純化的HTG的活性
[0233] 表明在木賊屬的硫酸錠沉淀級(jí)分中的多種蛋白質(zhì)能夠轉(zhuǎn)糖基，它們中的一些展現(xiàn) 出XET活性，并且至少另一種酶MXE能夠使用MLG或XyG作為供體底物。對(duì)于使用等點(diǎn)聚焦 (Rotofor)獲得的并且含有兩種酶活性MXE和XET的木賊屬提取物的部分純化級(jí)分，測(cè)試了 它們利用纖維素作為供體底物的能力(表2)。
[0234] 表2:來自部分純化的HTG的巧E活性
[0236] 將部分純化的（pp)MXE、卵XET、ASP、或僅緩沖液(0.3M削i酸鹽，pH6.3)與[ 3H] XXXGol (化Bq)、巧樣酸鹽緩沖液（達(dá)IOOiil )、和IOmg的沃特曼ICHR紙（未處理）一起解育 3.3h。用FA (3化1)停止反應(yīng)，并用水洗出未使用的反應(yīng)物。將該紙(在5ml水中）在閃爍體中 解育并測(cè)定3Hd
[0237] 部分純化的HTG級(jí)分含有高水平的CXE活性，但是具有XET活性的級(jí)分只是未使用 纖維素作為供體底物。雖然MXE級(jí)分不是一種純的蛋白質(zhì)，但它僅僅含有少許并高度富集一 種蛋白質(zhì)。在另一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，測(cè)試了含有MXE活性的一系列Rotofor純化的級(jí)分的CXE活性、 W及與高M(jìn)XE和XET活性模式直接關(guān)聯(lián)的高CXE活性模式(圖5)。運(yùn)種酶可W是相對(duì)無差別的 轉(zhuǎn)葡糖基酶，其能使用e-( 1^4)-葡聚糖，而不論側(cè)鏈或其他主鏈連接如何。
[0238] 使用不同的供體和受體底物的MXE活性的總結(jié)
[0239] 部分純化的MXE級(jí)分能夠使用纖維素、MLG、或XyG作為關(guān)于許多受體底物的供體底 物(表3)。雖然MLG是比XyG更好的供體底物，但與作為供體受體的纖維素的活性率的直接比 較是困難的。溶液中的多糖如MLG或XyG的濃度不能與水中的固體的相似濃度進(jìn)行比較。另 夕h包埋在固體底物如纖維素中或其上的氣是W比溶液中的氣更低的效率計(jì)數(shù)的，從而降 低了檢測(cè)CXE產(chǎn)物的能力。因此，MXE和XET活性可與CXE活性直接比較，但只是粗略比較。
[0240] 表3:使用不同的供體和受體底物的MXE活性的總結(jié) [0241 ]與W下受體的相對(duì)反應(yīng)速率：
[0243] (縮寫:GM =葡甘露聚糖，XyG =木葡聚糖，MLGO =混合鍵葡聚糖寡糖，Cello6ol = 纖維己糖醇，XXre =具有葡萄糖4.木糖3.半乳糖1.巖藻糖1組成的木葡聚糖的九糖）
[0244] CXE 活性
[0245] 眾多觀察證實(shí)了纖維素:木葡聚糖內(nèi)轉(zhuǎn)葡糖基酶活性。
[0246] 如果相同的木葡聚糖分子可被附接至兩根鄰接的纖維素微纖絲，則運(yùn)些微纖絲它 們自身能夠通過XyG中間物共價(jià)附接(圖4)。共價(jià)連接的纖維素網(wǎng)絡(luò)會(huì)比氨鍵網(wǎng)絡(luò)更強(qiáng)。
[0247] 實(shí)例3:編碼具有巧巧舌性的HTG蛋白的基因的追蹤和測(cè)序
[0248] 使用化izol試劑（英杰公司）從溪木賊個(gè)體的成熟芽制備RNA。用6￥1'〇旨日111;[]11：-Universal cDNA合成試劑盒制備cDNA，用Evrogen TrimmeH式劑盒將其標(biāo)準(zhǔn)化，并使用454 測(cè)序技術(shù)進(jìn)行測(cè)序。使用羅氏專有的化Wbler匯編器2.5型，將原始數(shù)據(jù)組裝成重疊群和重 疊群序列（isotigs)。
[0249] 為了鑒定木賊屬中具有巧E活性的蛋白質(zhì)，遵循了 W下途徑：
[0250] 通過四種順序的技術(shù):差速硫酸錠沉淀、凝膠滲透色譜法、凝集素親和色譜法和等 電聚焦從粗制溪木賊提取物中純化HTG。通過SDS PAGE分離所得樣品，從SDS PAGE中切下單 個(gè)占優(yōu)勢(shì)的約30kDa的條帶。用膜蛋白酶消化樣品，并通過MLDI-ToF和LC-MS進(jìn)行分析。
[0251] 為了鑒定祀基因，翻譯了木賊屬轉(zhuǎn)錄組并將推斷的蛋白質(zhì)進(jìn)行計(jì)算機(jī)模擬膜蛋白 酶消化。根據(jù)從部分純化的IEF制備的約30kDa的級(jí)分，具有最高得分的兩個(gè)重疊群序列 (isotigs)是XTH同源蛋白的部分基因序列。通過使用5'和3'RACE鑒定了兩個(gè)候選基因的全 長(zhǎng)序列，結(jié)果顯示運(yùn)些候選基因是同一個(gè)全長(zhǎng)基因的兩個(gè)部分。所述蛋白質(zhì)具有預(yù)期的 4.66的Pl和預(yù)期的29.化化的質(zhì)量。編碼序列顯示在SEQ ID NO: 1中，并且編碼的蛋白質(zhì)的 序列顯示在SEQ ID N0:2中。據(jù)預(yù)測(cè)，SEQ ID N0:2的氨基酸1-21相應(yīng)于信號(hào)膚，并且氨基酸 22-280相應(yīng)于成熟蛋白，由此SEQ ID NO: 1的核巧酸1-63編碼所述信號(hào)膚，并且核巧酸64-840編碼所述成熟蛋白。
[0252] SEQ ID NO 1和2的序列用來捜索(blast)可公開獲得的序列數(shù)據(jù)庫。發(fā)現(xiàn)了兩個(gè) 同源基因，一個(gè)來自木賊巧quisetum hye皿Ie)(沈Q ID N0:5為編碼序列，其與沈Q ID NO: 1的核巧酸序列具有83%序列一致性，并且SEQ ID NO:6為編碼的蛋白質(zhì)，其與SEQ ID NO: 2 的氨基酸序列具有75%的序列一致性），而一個(gè)來自披散木賊化quisetum diffusum) (SEQ ID N0:7為編碼序列，其與SEQ ID NO: 1的核巧酸序列具有94%的序列一致性，并且SEQ ID N0:8為編碼的蛋白質(zhì)，其與SEQ ID N0:2的氨基酸序列具有91%的序列一致性）。木賊HTG蛋 白的核巧酸序列和氨基酸序列的比對(duì)顯示在圖8中。據(jù)預(yù)測(cè)，SEQ ID N0:6的氨基酸1到25相 應(yīng)于信號(hào)膚，并且氨基酸26到283相應(yīng)于成熟蛋白，由此SEQ ID NO: I的氨基酸I到28相應(yīng)于 所述信號(hào)膚，并且氨基酸29到287相應(yīng)于所述成熟蛋白。因此，SEQ ID N0:5的核巧酸1-75編 碼該信號(hào)膚，并且SEQ ID N0:5的核巧酸76-849編碼該成熟蛋白，并且SEQ ID N0:7的核巧 酸1-84編碼該信號(hào)膚，且SEQ ID N0:7的核巧酸85-861編碼該成熟蛋白。預(yù)測(cè)的成熟蛋白， 即，SEQ ID N0:6的氨基酸26到283與預(yù)測(cè)的成熟蛋白，即，SEQ ID N0:2的氨基酸22-280具 有79%的序列一致性，而預(yù)測(cè)的成熟蛋白，即，SEQ ID N0:8的氨基酸29到287與成熟蛋白， 良P，沈Q ID NO:2的氨基酸22-280具有94%的序列一致性。
[0253] 實(shí)例4:在畢赤酵母中表達(dá)的重組HTG的MXE、XET和巧E活性。
[0254] 通過轉(zhuǎn)化到畢赤酵母(SMD1168H)中插入之后，溪木賊的