猴病毒40衣殼蛋白vp1在作為細胞穿膜蛋白中的應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及細胞轉(zhuǎn)導技術領域，更具體涉及猴病毒40衣殼蛋白VPl在作為細胞穿膜蛋白中的應用。猴病毒40主要衣殼蛋白VPl能夠穿透哺乳動物細胞膜，進入細胞內(nèi)并定位于細胞質(zhì)中。將SV40 VPl蛋白與其它蛋白相融合，VPl可以把與其融合的外源蛋白轉(zhuǎn)導進入細胞并定位于細胞質(zhì)。
【背景技術】
[0002]隨著分子生物學理論與技術的發(fā)展，以基因治療、靶向蛋白質(zhì)藥物或多肽藥物為主的新的分子治療措施應運而生，但是這些治療手段往往以向細胞內(nèi)輸送大分子物質(zhì)為前提。由于細胞膜的選擇透過性作用，蛋白質(zhì)、多肽和DNA等極性強及分子量大的物質(zhì)不能自由穿過，必須借助特殊的轉(zhuǎn)運機制或一定的生物學手段才能進入細胞內(nèi)。傳統(tǒng)的介導外源物質(zhì)進入細胞的技術包括電穿孔、微注射、病毒運輸系統(tǒng)、反復凍融技術、脂質(zhì)體包裹等，但因為這些技術損傷性強、毒性大、效率低而在應用上受到很大限制。另外，藥物進入細胞后因為溶酶體的降解，實際利用度往往非常低。因此，尋找更加有效的運輸載體是當前藥物治療迫切需要解決的課題。
[0003]近二十年來，具有細胞穿透能力的蛋白質(zhì)與細胞穿透肽的發(fā)現(xiàn)給細胞內(nèi)藥物運輸帶來了希望。細胞穿透蛋白質(zhì)或細胞穿透肽具有強大的細胞穿透能力，自身能夠穿透細胞膜進入細胞內(nèi)。到目前為止，許多細胞穿透蛋白質(zhì)或細胞穿透肽已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)。細胞穿透蛋白質(zhì)或細胞穿透肽可以分為兩大類:第一類需要與藥物共價連接后細胞攜帶藥物內(nèi)化進入細胞，第二類與藥物形成穩(wěn)定的非共價復合物，攜帶藥物進入細胞。細胞穿透蛋白質(zhì)或細胞穿透肽能夠可以攜帶多種物質(zhì)，包括親水性蛋白、多肽、DNA甚至顆粒性物質(zhì)進入細胞，甚至可以攜帶其進行細胞間或細胞內(nèi)的運輸，并且不受細胞類型的限制，在細胞生物學、基因治療學以及藥學等領域具有巨大潛力。在轉(zhuǎn)導入細胞后，能快速地從內(nèi)涵體中釋放，到達靶標，具有高效性，沒有細胞毒作用，免疫原性低等優(yōu)點，在物質(zhì)運輸領域得到廣泛的應用。
[0004]目前一些具有穿透細胞膜功能的蛋白質(zhì)已經(jīng)用于外源物質(zhì)的運輸，如HIV-1Tat蛋白、果蠅觸角足同源蛋白(pANTP)和HSV-1 VP22等。歷史上第一個顯示蛋白質(zhì)可能包含負責穿透細胞膜的序列是在1988年來自對HIV-1 Tat蛋白86個氨基酸長度的片段(Tat-86)被活細胞內(nèi)化的觀察。Frankel和Pabo發(fā)現(xiàn)HIV-1的轉(zhuǎn)錄激活因子Tat蛋白可以進入細胞并轉(zhuǎn)導到細胞核里。1991年Prochiantz研究小組證明60個氨基酸的果蠅觸角足蛋白(Drosophila Anten napedia homeoprotein, pANTP)能夠穿透細胞膜，被神經(jīng)細胞內(nèi)化。這個研究工作是后來在1994年發(fā)現(xiàn)第一個PTD或者叫CPP的起源。為了理解果蠅觸角蛋白的內(nèi)化驅(qū)動力，對其同源域進行點突變，發(fā)現(xiàn)它的第三個螺旋結(jié)構(gòu)是膜轉(zhuǎn)位的必要和充分條件，結(jié)果把這16個氨基酸長的CPP叫做穿透肽penetratin (RQIKIYFQNRRMKffKK)后來改稱為pAntp。很快其他CPPs例如HIV-1 Tat蛋白的基本序列，運輸子嵌合多肽和人工合成的兩性分子模型多肽陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)。
[0005]1998年Lebleu研究小組定義了 Tat被細胞攝取所需要的最小肽段序列(47YGRKKRRQRRR57)。1997年，Heitz和Divita研究小組設計出第一個非共價CPP運輸核酸MPG進入細胞,緊接著又利用Pep-1運輸?shù)鞍踪|(zhì)和多肽進入細胞。Wender和Futaki兩個研究小組證明聚精氨酸序列(ArgS)可以攜帶分子進入細胞，進而提出它們的攝取機制包括精氨酸胍鹽基團和細胞膜上的磷酸基團的二氫鍵相互作用。CPP研究領域最重要的突破來自它們在或體內(nèi)的第一個應用。Dowdy研究小組利用CPP運輸小肽和大蛋白質(zhì)進入體，Lange利用運輸子嵌合多肽運輸PNAs。自此，許多其他的CPPs都被設計出來攜帶外源物質(zhì)跨過細胞膜進入細胞質(zhì)。
[0006]猴病毒40(SV40)屬于多瘤病毒科，是最簡單的dsDNA病毒之一，也是基因治療的候選載體之一，相對其它載體，SV40病毒具有免疫原性低、容易生產(chǎn)、更高的專一性、高滴度、高轉(zhuǎn)染率等優(yōu)勢。SV40病毒顆粒為直徑約45nm的正二十面體結(jié)構(gòu)。病毒衣殼由360拷貝的VPl和約30-60拷貝的VP2與VP3構(gòu)成。其中主要衣殼蛋白VPl可以自組裝形成24nm正二十面體病毒樣顆粒，且能以與野生型病毒類似的途徑“侵染”細胞。本發(fā)明利用大腸桿菌表達后純化獲得VPl蛋白，在不形成正二十面體顆粒結(jié)構(gòu)的情況下與多種細胞孵育，發(fā)現(xiàn)VPl能夠穿透哺乳動物細胞膜，進入細胞內(nèi)并定位于細胞質(zhì)中。當VPl蛋白與其它外源蛋白融合表達，VPl可以把與其融合的蛋白轉(zhuǎn)導進入細胞并定位于細胞質(zhì)，實現(xiàn)目的蛋白的細胞轉(zhuǎn)導。
[0007]由于細胞穿透蛋白質(zhì)在蛋白和藥物運輸中的巨大優(yōu)勢和潛力，申請人研究發(fā)現(xiàn)了SV40 VPl能夠穿透細胞膜進入細胞質(zhì)，是一種新的細胞穿透蛋白，進一步利用VPl細胞膜穿透能力，使其攜帶外源蛋白如突光蛋白mCherry和抑癌蛋白P53進入細胞,說明VPl能夠運輸外源蛋白進入細胞，是一種優(yōu)良的細胞轉(zhuǎn)導體系。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明的目的是在于提供了猴病毒40衣殼蛋白VPl在作為細胞穿膜肽中的應用，包括其轉(zhuǎn)導外源蛋白進入細胞的應用。大腸桿菌表達的猴病毒40主要衣殼蛋白VPl能夠穿透哺乳動物細胞膜，進入細胞內(nèi)并定位于細胞質(zhì)中，是一種細胞穿透蛋白。同時，其能攜帶外源蛋白穿透細胞膜，進入細胞并定位于細胞質(zhì)。是一種簡單高效的細胞轉(zhuǎn)導系統(tǒng)。
[0009]為了實現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用以下技術措施:
[0010]猴病毒40衣殼蛋白VPl (在本發(fā)明中或稱SV40VP1或VPl)基因，其制備步驟如下:
[0011]以pSV21SphI_Nl質(zhì)粒為模板，PCR擴增獲得猴病毒40衣殼蛋白VPl基因片段，即為SV40VP1，其序列為SEQ ID N0.1所示，編碼的蛋白質(zhì)為SEQ ID N0.2所示。
[0012]PCR 使用的上游引物:VP1_S(NcoI):5 ' CAGACCATGGATGAGAGGATCGCATCACCATCACCATCACGGATCTATGAAGATG 3 '，下游引物:VP1_A(SacI):5 ' GCTTGAGCTCGCACTGCATTCTAGTTGTGG 3 ^。將SV40 VPl基因用NcoI和SacI雙酶切插入到pET28a表達載體，獲得pET28a-hisVPl 質(zhì)粒。
[0013]猴病毒40衣殼蛋白VPl在作為細胞穿膜肽中的應用，將純化的VPl蛋白加入三種不同的哺乳動物細胞(Vero細胞、Hela細胞、293T細胞)中，孵育，免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)，VPl蛋白穿透細胞膜進入細胞，并定位于細胞質(zhì)。
[0014]細胞穿透蛋白VPl轉(zhuǎn)導外源蛋白進入細胞的應用，包括將SV40 VPl基因與外源蛋白基因連接表達后，攜帶外源蛋白進入細胞。
[0015]SV40 VPl攜帶mCherry蛋白穿膜進入細胞質(zhì):
[0016](I)熒光蛋白mCherry基因通過SacI和XhoI雙酶切位點插入到pET28a_hisVPl載體上，構(gòu)建出質(zhì)粒pET28a_VPImCherry。
[0017](2)質(zhì)粒 pET28a_VPImCherry 轉(zhuǎn)化入 E.CoIi Rosetta (DE3)感受態(tài)細胞，IPTG 誘導表達，獲得VPl-mCherry蛋白。
[0018](3)純化的VPl-mCherry蛋白加入培養(yǎng)于直徑35毫米小皿的Vero細胞中，冰上孵育，觀察mCherry的突光信號,發(fā)現(xiàn)VPl-mCherry融合蛋白的突光信號位于細胞質(zhì)中。
[0019]SV40 VPl攜帶P53蛋白穿膜進入細胞質(zhì):
[0020](1)P53蛋白的基因通過SacI和XhoI雙酶切位點插入到pET28a_hisVPl載體上，構(gòu)建出質(zhì)粒pET28a-VPlP53，雙酶切驗證質(zhì)粒構(gòu)建成功。
[0021](2)質(zhì)粒 pET28a_VPlP53 轉(zhuǎn)化入 E.coll Rosetta(DE3)感受態(tài)細胞，IPTG 誘導表達，獲得融合蛋白VP1-P53，其序列為SEQ ID N0.3所示。
[0022](3)純化的VP1-P53蛋白加入培養(yǎng)于直徑35毫米小皿的Vero細胞中，冰上孵育，免疫熒光測定發(fā)現(xiàn)VP1-P53進入細胞內(nèi)并定位于細胞質(zhì)。
[0023]本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比，具體以下優(yōu)點和效果:
[0024]本研究首次發(fā)現(xiàn)猴病毒40主要衣殼蛋白VPl能夠穿透哺乳動物細胞膜，進入細胞內(nèi)并定位于細胞質(zhì)中，是一種新的細胞穿透蛋白。基于VPl蛋白可以穿透細胞膜進入細胞的功能，如果VPl蛋白與其它蛋白相融合，VPl可以把與其融合的外源蛋白轉(zhuǎn)導進入細胞并定位于細胞質(zhì)。以熒光蛋白mCherry和抑癌蛋白P53為模型，說明了 VPl可以攜帶熒光蛋白mCherry或P53蛋白穿透細胞膜,進入細胞并定位于細胞質(zhì),所以本發(fā)明提供了一種簡單高效的細胞轉(zhuǎn)導系統(tǒng)，并且實現(xiàn)了在細胞質(zhì)中的亞細胞定位。另外，所構(gòu)建的VP1-P53蛋白還有望在腫瘤靶向治療等方面有所應用。
【附圖說明】
[0025]圖1-a pET28a-hisVPl酶切鑒定電泳圖譜。
[0026]泳道1: DNA Marker ;泳道 2: pET28a_hisVPl 質(zhì)粒用 NcoI 和 SacI 雙酶切。。
[0027]圖1-b pET28a_VPlmCherry酶切鑒定電泳圖譜。
[0028]泳道1:DNA Marker ;泳道 2:pET28a_VPImCherry 質(zhì)粒用 SacI 和 XhoI 雙酶切。
[0029]圖1-c pET28a_VPlP53酶切鑒定電泳圖譜。
[0030]泳道1:DNA Marker ;泳道 2:pET28a_VPlP53 質(zhì)粒用 SacI 和 XhoI 雙酶切。
[0031]圖2聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定純化后的蛋白質(zhì)。
[0032]泳道a:VPl蛋白，泳道b:融合蛋白VPl-mCherry,泳道c:融合蛋白VPl_p53。