特異性識(shí)別重金屬Cd的納米抗體及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及單克隆抗體技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及特異性識(shí)別重金屬Cd的 納米抗體及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著工業(yè)的迅速發(fā)展，鎘（Cd)的生產(chǎn)和使用不斷增加，環(huán)境鎘污染及其引起的疾 病不時(shí)可見報(bào)導(dǎo)。最近研究表明，一般人群中低劑量鎘環(huán)境暴露即可引起腎功能損傷、骨礦 密度降低、鈣排泄增加及生殖毒性。因此檢測(cè)環(huán)境中或樣品中的重金屬鎘的存在與否以及 存在量是非常重要的。
[0003] 傳統(tǒng)的重金屬離子檢測(cè)方法主要有原子吸收光譜法、紫外分光光度法、陽極溶出 伏安法、示波極譜法和各種儀器聯(lián)用技術(shù)，如電感耦合等離子體質(zhì)譜法、電感耦合等離子體 原子發(fā)射廣譜分析等；這些分析方法雖然能夠?qū)Νh(huán)境中的鎘離子進(jìn)行有效分析，而且測(cè)量 精度較高，但它們大多需要大型儀器，成本高，樣品要經(jīng)過消解，檢測(cè)步驟煩瑣，不適合現(xiàn) 場、在線分析檢測(cè)，難以適應(yīng)現(xiàn)場抽查、大規(guī)模檢測(cè)的需求。
[0004] 重金屬免疫檢測(cè)方法為重金屬污染物檢測(cè)提供了另一種方式，這種方法檢測(cè)速度 快、費(fèi)用低廉、易于現(xiàn)場使用。但是，重金屬的免疫檢測(cè)的關(guān)鍵在于重金屬特異性抗體的制 備。由于重金屬離子帶有電荷，能與動(dòng)物體內(nèi)生物分子發(fā)生強(qiáng)烈的不可逆反應(yīng)，導(dǎo)致動(dòng)物中 毒，因此，常規(guī)的制備抗體的方法得不到理想的抗體。并且，重金屬離子本身分子量很小不 具有免疫原性，且其本身帶有電荷，會(huì)與分子發(fā)生強(qiáng)烈的不可逆反應(yīng)，所以需選擇合適的載 體蛋白以制成完全的免疫原。
[0005] 然而，即使獲得了合適的攜帶重金屬離子的免疫原，后續(xù)篩選抗體的過程仍然存 在較多的瓶頸，特別是在完全免疫原中金屬離子很小，篩選過程中獲得的特異性抗體很微 小，甚至難以鑒定到；而針對(duì)完全免疫原中金屬離子以外的材料如螯合劑、載體蛋白的特異 性抗體將占很大比例；因此篩選難度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于常規(guī)的單抗篩選方法。
[0006] 綜上，本領(lǐng)域需要開發(fā)用于檢測(cè)重金屬Cd的免疫檢測(cè)抗體，以期應(yīng)用于實(shí)時(shí)重金 屬檢測(cè)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供特異性識(shí)別重金屬Cd的納米抗體及其應(yīng)用。
[0008] 在本發(fā)明的第一方面，提供一種特異性識(shí)別重金屬Cd的納米抗體，所述的納米抗 體的互補(bǔ)決定區(qū)具有下組的氨基酸序列：
[0009] SEQ ID N0:2 所示的 CDR1，
[0010] SEQ ID NO:3 所示的 CDR2,和
[0011] SEQ ID NO :4 所示的 CDR3。
[0012] 在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的納米抗體的骨架區(qū)具有下組的氨基酸序列：
[0013] SEQ ID N0:5 所示的 FR1，
[0014] SEQ ID N0:6 所示的 FR2，
[0015] SEQ ID NO:7 所示的 FR3,和
[0016] SEQ ID NO:8 所示的 FR4。
[0017] 在另一優(yōu)選例中，所述的納米抗體的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0018] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種多核苷酸，其編碼所述的納米抗體。
[0019] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種表達(dá)載體，該表達(dá)載體中含有所述的多核苷酸。
[0020] 在另一優(yōu)選例中，所述的多核苷酸可以通過分子克隆技術(shù)克隆至表達(dá)載體pET28a 中，進(jìn)行表達(dá)。
[0021] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種宿主細(xì)胞（為非繁殖細(xì)胞），該宿主細(xì)胞中含有所 述的表達(dá)載體或其基因組中整合有所述的多核苷酸。
[0022] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種產(chǎn)生納米抗體的方法，包括：培養(yǎng)所述的宿主細(xì) 胞，使之表達(dá)所述的納米抗體。
[0023] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種納米抗體噬菌體（噬菌粒），其包括：噬菌體（噬 菌粒），以及展示于噬菌體表面的所述的納米抗體。
[0024] 在另一優(yōu)選例中，所述的噬菌體是商業(yè)化噬菌體，即是常規(guī)用于進(jìn)行蛋白展示的 噬菌體。例如，所述的噬菌體是Ml3絲狀噬菌體。
[0025] 在本發(fā)明的另一方面，提供所述的納米抗體或所述的納米抗體噬菌體的用途，用 于檢測(cè)重金屬Cd ;或用于制備檢測(cè)重金屬Cd的試劑或試劑盒。
[0026] 在另一優(yōu)選例中，所述的用途為非診斷性的用途。較佳地，用于檢測(cè)來自人體或動(dòng) 物體以外的樣品（如水、藥品、食品、農(nóng)藥、飼料、飲品、保健品等）中的重金屬Cd。
[0027] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種用于檢測(cè)重金屬Cd的試劑盒，所述的試劑盒中包 括所述的納米抗體或所述的納米抗體噬菌體。
[0028] 在一個(gè)優(yōu)選例中，所述試劑盒中還包括固相載體，所述的納米抗體或納米抗體噬 菌體被固定于固相載體（如多孔板、蓋玻片、微珠）或游離存在。
[0029] 在另一優(yōu)選例中，所述試劑盒中還包括：
[0030] 能與所述的納米抗體連接的可檢測(cè)標(biāo)記物（如HRP)，所述的可檢測(cè)標(biāo)記物被連接 于所述的納米抗體或分離地存在于試劑盒；和/或
[0031] Cd標(biāo)準(zhǔn)品或Cd偶聯(lián)物（為Cd與載體蛋白的偶聯(lián)物，如Cd-DTPA-BSA、 Cd-DTPA-〇VA)標(biāo)準(zhǔn)品；和/或
[0032] 與可檢測(cè)標(biāo)記物相對(duì)應(yīng)的底物；和/或
[0033] 酶聯(lián)免疫反應(yīng)試劑（包括但不限于：包被（緩沖）液，洗滌（緩沖）液，封閉液，固 定液，終止液，顯色液）；和/或
[0034] 說明檢測(cè)重金屬Cd的方法的使用說明書。
[0035] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種檢測(cè)待測(cè)樣品中重金屬Cd存在情況的方法，所述 方法包括：
[0036] 以所述的納米抗體或所述的納米抗體噬菌體作為重金屬Cd的檢測(cè)抗體，通過酶 聯(lián)免疫反應(yīng)法來檢測(cè)待測(cè)樣品中重金屬Cd的存在情況。
[0037] 在另一優(yōu)選例中，將待測(cè)樣品包被于固相載體上，以攜帶或不攜帶可檢測(cè)標(biāo)記物 (以攜帶可檢測(cè)標(biāo)記物的抗抗體進(jìn)一步結(jié)合）的所述的納米抗體或所述的納米抗體噬菌體 作為檢測(cè)抗體，檢測(cè)重金屬Cd的存在情況。
[0038] 在另一優(yōu)選例中，所述的方法為非診斷性的方法。所述的待測(cè)樣品是來自人體或 動(dòng)物體以外的樣品（如水、藥品、食品、農(nóng)藥、飼料、飲品、保健品等）。
[0039] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種篩選特異性識(shí)別重金屬Cd的納米抗體的方法，所 述方法包括：
[0040] (1)將Cd分別與載體蛋白BSA、0VA偶聯(lián)，分別獲得Cd與BSA偶聯(lián)物和Cd與0VA 偶聯(lián)物；
[0041] ⑵分別以⑴獲得的Cd與BSA偶聯(lián)物和Cd與0VA偶聯(lián)物作為抗原，篩選納米抗 體庫，富集與之特異性結(jié)合的納米抗體；篩選方案為以Cd與BSA偶聯(lián)物和Cd與0VA偶聯(lián)物 交替進(jìn)行篩選，篩選3-8輪；
[0042] (3)應(yīng)用酶聯(lián)免疫反應(yīng)法來鑒定特異性識(shí)別重金屬Cd的納米抗體，獲得特異性良 好的納米抗體。
[0043] 本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見 的。
【附圖說明】
[0044] 圖1、本發(fā)明的實(shí)施例中進(jìn)行的研究工作的整體流程步驟示意圖。
[0045] 圖 2、SDS-PAGE 分子量檢測(cè)的結(jié)果。其中，1、Marker ;2、BSA ;3、DTPA-BSA ; 4、Cd-DTPA-BSA ;5、0VA ;6、DTPA-0VA ;7、Cd-DTPA-〇VA ;8、Cd-DTPA-BSA 超濾液；9、 Cd-DTPA-〇VA 超濾液。
[0046] 圖3、抗原紫外檢測(cè)圖譜。
[0047] 圖4、噬菌體VHH庫的富集篩選示意圖。
[0048] 圖5、Cd-DTPA抗體庫第一至七輪抗體庫富集度。
[0049] 圖6、Cd-DTPA抗體庫富集度及特異性檢測(cè)。
[0050] 圖7、第四輪單克隆ELISA驗(yàn)證。
[0051] 圖8、第六輪單克隆ELISA驗(yàn)證。
[0052] 圖9、Cd-單克隆噬菌體VHH-螯合物競爭性ELISA示意圖。
[0053] 圖10、第四輪陽性單克隆特異性初檢測(cè)。
[0054] 圖11、第六輪陽性單克隆特異性初檢測(cè)。
[0055] 圖12、Cd-VHH-螯合物競爭性ELISA結(jié)果。
[0056] 圖 13、Cd-DTPA-VHH 4-18 親和常數(shù) Kaff 測(cè)定。
[0057] 圖14、Cd-DTPA-VHH 4-18與DTPA濃度關(guān)系摸索結(jié)果。
[0058] 圖 15、Cd-DTPA-VHH 4-18 與 Cd-DTPA 及 DTPA 間接競爭性 ELISA。
[0059] 圖16、間接競爭性ELISA標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線。
[0060] 圖17、測(cè)定Cd-單克隆抗體（Cd-DTPA-VHH 4-18)與其他重金屬的交叉反應(yīng)的間接 競爭性ELISA標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線。
[0061] 圖18、間接競爭性ELISA檢測(cè)法檢測(cè)加強(qiáng)的水樣。
【具體實(shí)施方式】
[0062] 本發(fā)明人經(jīng)過深入的研究和試驗(yàn)，揭示了一種針對(duì)重金屬Cd的納米抗體，所述的 納米抗體對(duì)于重金屬Cd具有良好的特異性，與其它金屬的交叉反應(yīng)性很低。本發(fā)明的納米 抗體可靈敏檢測(cè)重金屬Cd，重復(fù)性好，結(jié)果穩(wěn)定；利用所述的納米抗體，可制備方便、快速 且準(zhǔn)確地檢測(cè)重金屬Cd的試劑盒。
[0063] 術(shù)語
[0064] 如本文所用，所述的"納米抗體"是指缺失輕鏈的重鏈抗體（如：來源于駱駝體 內(nèi)），克隆其可變區(qū)得到的單域抗體，是最小的功能性抗原結(jié)合片段，相對(duì)分子質(zhì)量（Mr)僅 約為15000。納米抗體具有分子質(zhì)量小、穩(wěn)定性強(qiáng)、可溶性好、易表達(dá)，免疫原性低等特點(diǎn)。 [0065] 如本文所用，所述的"檢測(cè)抗體"是指特異性地抗重金屬Cd的抗體。
[0066] 如本文所用，所述的"可檢測(cè)標(biāo)記物"是指位于檢測(cè)抗體上的，用于確定待檢測(cè)樣 品中重金屬Cd的存在與否以及存在的量的標(biāo)志物。如：酶、熒光標(biāo)記、核素、量子點(diǎn)、膠體金 等。優(yōu)選的，所述的標(biāo)記物選自：辣根過氧化物酶（HRP)、堿性磷酸酯酶（AP)、葡萄糖氧化 酶、β -D-半乳糖苷酶、脲酶、過氧化氫酶、或葡萄糖淀粉酶。
[0067] 如本文所用，所述的"與可檢測(cè)標(biāo)記物相對(duì)應(yīng)的底物"是指可被檢測(cè)抗體的標(biāo)記物 所催化顯色，用于顯示檢測(cè)抗體與重金屬Cd發(fā)生結(jié)合的識(shí)別信號(hào)。所述的底物比如：用于 辣根過氧化物酶的鄰苯二胺（0PD)、四甲基聯(lián)苯胺（TMB)、ABTS ;用于堿性磷酸酯酶的對(duì)硝 基苯憐酸酯（p-nitrophenyl phosphate，p-NPP);等等。
[0068] 抗重金屬Cd蛋白的納米抗體
[0069] 本發(fā)明提供了一種納米抗體，所述的納米抗體篩選自駝源性天然單域重鏈抗體 庫。
[0070] 本發(fā)明所述的納米抗體，能高親和力特異性與重金屬Cd結(jié)合。
[0071] 本發(fā)明也包括所述的納米抗體的變異體、衍生物和類似物。如本文所用，術(shù)語"變 異體"、"衍生物"和"類似物"是指基本上保持本發(fā)明的納米抗體相同的生物學(xué)功能或活性 的多肽。本發(fā)明的多肽變異體、衍生物或類似物可以是（i)有一個(gè)或多個(gè)保守或非保守性 氨基酸殘基（優(yōu)選保守性氨基酸殘基）被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是 也可以不是由遺傳密碼編碼的，或（ii)在一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基中具有取代基團(tuán)的多肽， 或（iii)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽（如前導(dǎo)序列或分泌序列或用 來純化此多肽的序列或多肽原序列，或融合多肽）。根據(jù)本文的定義這些變異體、衍生物和 類似物屬于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的范圍。
[0072] 此外，在所述的納米抗體的氨基端或羧基端還可添加其它基本上不影響本發(fā)明所 述的納米抗體的活性、表達(dá)量和穩(wěn)定性的氨基酸序列。較佳地，這些添加的氨基酸序列有利 于表達(dá)（如信號(hào)肽），有利于純化（如6 X His序列），或其它可促進(jìn)所述的納米抗體的活性、 表達(dá)量或穩(wěn)定性的序列。
[0073] 本發(fā)明還包括編碼本發(fā)明的納米抗體或其變異體、衍生物的DNA分子。所述的DNA 分子可以全部人工合成，也可用PCR擴(kuò)增的方法獲得。
[0074] 為了進(jìn)一步提高宿主細(xì)胞的表達(dá)量，可以對(duì)本發(fā)明的納米抗體的編碼序列進(jìn)行改 造，例如采用宿主細(xì)胞偏好的密碼子，消除不利于基因轉(zhuǎn)錄及翻譯的序列。
[0075] 在獲得了編碼本發(fā)明新納米抗體或其變異體、衍生物的DNA序列之后，將其克隆 入合適的表達(dá)載體，再轉(zhuǎn)入合適的宿主細(xì)胞。最后，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化后的宿主細(xì)胞，通過分離純化 得到本發(fā)明的新的納米抗體。
[0076] 如本文所