一種組織蛋白酶b可裂解的嵌段聚合物及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)、納米醫(yī)藥及新材料領(lǐng)域，具體涉及以組織蛋白酶B(CB)可降解的嵌段聚合物的合成及其組裝方法、以及應(yīng)用于制備對腫瘤細(xì)胞具有增強的細(xì)胞內(nèi)藥物控制釋放特性的智能納米膠束載體的用途。
【背景技術(shù)】
[0002]通常細(xì)胞毒性藥物是一類可有效殺傷免疫細(xì)胞并抑制其增殖的藥物，可用于抗惡性腫瘤，也可用作免疫抑制劑，是化療的主要用藥，主要通過毒化某些快速增長和分裂的細(xì)胞來治療癌癥。這類藥物因具有致癌、致畸、生殖毒性以及低劑量時致系列器官毒性等毒副作用，從而影響了其臨床療效的發(fā)揮。納米藥物載體為實現(xiàn)細(xì)胞毒藥物在腫瘤組織內(nèi)的定點和快速釋放，減少對正常組織器官的損傷，避免有效藥物劑量不足導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性提供了一個有效途徑。智能納米藥物載體系統(tǒng)主要是基于腫瘤組織與人體正常組織的微環(huán)境差異，如腫瘤組織具有乏氧、酸性PH值、溫度稍高、有大量生長因子及水解蛋白酶等特點。利用實體瘤的高滲透和長滯留效應(yīng)(EPR效應(yīng))，可使納米載體藥物在腫瘤組織富集，在腫瘤微環(huán)境作用下快速解體，迅速釋放出抗腫瘤藥物“殺死”腫瘤細(xì)胞。
[0003]CB是溶酶體內(nèi)半胱氨酸蛋白水解酶，其催化作用由Cys，Hi s實現(xiàn)，屬于木瓜蛋白酶家族，在pH3.0-7.0都具有活性，堿性條件下會不可逆失活，其水解位點為-Arg-Arg-/-Xaa，且能夠在羧基端按順序水解二肽，因此也叫作羧基二肽酶。通常認(rèn)為CB在溶酶體降解蛋白質(zhì)過程中發(fā)揮著必不可少的作用，可以降解多種蛋白質(zhì)。利用原位雜交、Western blot及免疫組化等技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，胃癌、肺癌、腸癌、乳腺癌、前列腺癌等多種惡性腫瘤組織中，CB的表達(dá)及CB活性均成倍甚至3-9倍高于鄰近正常組織。利用CB可以選擇性地降解一些多肽片段的特點，可以構(gòu)建CB敏感的藥物傳遞系統(tǒng)。
[0004]Jan Feijen等利用CB敏感的四肽Gly-Phe-Leu-Gly為連接鍵合成了一種CB可降解的囊泡，并證明了在CB存在的條件下，由于四肽連接鍵的斷裂使囊泡的外殼解體，從而導(dǎo)致了藥物的快速釋放。而沒有CB存在時，囊泡保持穩(wěn)定。本發(fā)明人也曾合成一種以CB可降解的二肽Val-Cit為連接鍵的嵌段聚合物，但實驗表明其釋藥速率較慢。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了克服現(xiàn)有技術(shù)中的上述缺陷，本發(fā)明提供了一種CB可裂解的嵌段聚合物，所述嵌段聚合物以二肽和PABOH為連接鍵。本發(fā)明制備的嵌段聚合物可以用于構(gòu)筑納米膠束，具有較好的釋藥性和較低的細(xì)胞毒性。
[0006]本發(fā)明提出了一種組織蛋白酶B(CB)可裂解的嵌段聚合物，所述嵌段聚合物是以CB敏感的二肽和PABOH作為連接鍵。優(yōu)選地，以-Val-Cit-PABC-為連接鍵，其結(jié)構(gòu)如式(I)所示:
[0007]mPEG-Val-Cit-PABC-R2 式(I);
[0008]式(I)中，mPEG為甲氧基聚乙二醇的羧酸衍生物，R2為直鏈脂肪胺。
[0009]優(yōu)選地，所述嵌段聚合物的結(jié)構(gòu)如式(II)所示:
[0010]mPEG-Val-Cit-PABC-NH-Cn 式(II);
[0011]其中，mPEG甲氧基聚乙二醇的羧酸衍生物，平均分子量為1000-10000，Cn表示碳原子數(shù)，η為14-22。
[0012]本發(fā)明還提供了一種組織蛋白酶B(CB)敏感的嵌段聚合物的制備方法，該方法將連接鍵Val-Cit-PABC-PNP先與長鏈脂肪胺Cn-NH2反應(yīng)制得Val-Cit-PABC-NH-Cn后再與甲氧基聚乙二醇的羧酸衍生物反應(yīng)得到mPEG-Val-Cit-PABC-NH-Cn。所述mPEG-Val-Cit-PABC-NH-Cn的制備方法包括以下步驟:(I )Fmoc保護(hù)的連接鍵Fmoc-Val-Cit-PABC-PNP與長鏈脂肪胺Cn-NH2在DMAP的催化作用下反應(yīng)制得Fmoc-Val-Cit-PABC-NH-Cn; (2)在哌啶的作用下Fmoc-Val-Cit-PABC-NH-Cn脫去Fmoc的保護(hù)制得Val-Cit-PABC-NH-Cn; (3)脫保護(hù)后的Val-Cit-PABC-NH-Cn與甲氧基聚乙二醇的羧酸衍生物經(jīng)過脫水縮合反應(yīng)制得mPEG-Val-Cit-PABC-Cnο其中，mPEG為甲氧基聚乙二醇的羧酸衍生物，平均分子量為1000-10000，Cn表示碳原子數(shù)，η為14-22。
[0013]所述步驟(I)中，在二氯甲烷中室溫下反應(yīng)36小時。
[0014]所述步驟(2)中，反應(yīng)溶劑為二甲基甲酰胺，反應(yīng)溫度為室溫，反應(yīng)時間為2小時。
[0015]所述步驟(3)中，脫保護(hù)后的Val-Cit-PABC-NH-Cn與甲氧基聚乙二醇的羧酸衍生物在二甲基甲酰胺中，在室溫下條件下，與EDC1、H0Bt和Et3N反應(yīng)，經(jīng)過脫水縮合反應(yīng)24小時，制得 mPEG-Val-Cit-PABC-NH-Cn。
[0016]進(jìn)一步地，本發(fā)明的mPEG-Val-Cit-PABC-NH-Cn的制備方法，包括I )Fmoc保護(hù)的連接鍵Fmoc-Val-Cit-PABC-PNP與長鏈脂肪胺Cn-NH2在DMAP的催化作用下，于二氯甲烷中室溫下反應(yīng)36小時，反應(yīng)制得Fmoc-Val-Cit-PABC-NH-Cn; (2)將Fmoc-Val-Cit-PABC-NH-Cn溶解在二甲基甲酰胺中，加入哌啶，室溫下反應(yīng)2小時后，F(xiàn)moc-Val-Cit-PABC-NH-Cn脫去Fmoc的保護(hù)制得Val-Cit-PABC-NH-Cn; (3)脫保護(hù)后的Val-Cit-PABC-NH-Cn與甲氧基聚乙二醇的羧酸衍生物mPEG在二甲基甲酰胺中與EDC1、H0Bt和Et3N反應(yīng)24小時，經(jīng)過脫水縮合反應(yīng)制得mPEG-Val-Ci t-PABC-Cn。其中，mPEG為甲氧基聚乙二醇的羧酸衍生物，平均分子量為1000-10000，Cn表示碳原子數(shù)，η為14-22。
[0017]本發(fā)明進(jìn)一步提出了將所述嵌段聚合物用于制備藥物載體的應(yīng)用。所述嵌段聚合物以CB敏感的二肽和PABOH為連接鍵。所述嵌段聚合物包括式(I)、式(II)。
[0018]其中，所述藥物為脂溶性藥物;所述脂溶性藥物包括抗腫瘤藥物;所述抗腫瘤藥物包括SN-38、喜樹堿、紫杉醇、順鉑、阿霉素等。
[0019]其中，所述載體為納米膠束載體，優(yōu)選地，所述納米膠束載體為CB敏感型。
[0020]本發(fā)明提出了以所述嵌段聚合物用于制備對腫瘤細(xì)胞具有增強的細(xì)胞內(nèi)藥物控制釋放特性的智能納米膠束載體的用途。本發(fā)明利用腫瘤細(xì)胞中CB的過表達(dá)，利用對CB敏感的二肽和間隔化合物PABOH為連接鍵，合成了式(I I )mPEG-Va 1-Ci t-PABC-NH-Cn，進(jìn)而構(gòu)筑其載藥膠束，研究膠束在模擬的溶酶體條件下的釋藥行為，評價其體外毒性。
[0021 ] 在一具體實施方案中，以mPEG-Val-Cit-PABC-NH-C18為例，說明CB敏感的嵌段聚合物及其制備方法和應(yīng)用。
[0022](一)mPEG-Val-Cit-PABC-NH-C18嵌段聚合物的合成和表征
[0023](I )Fmoc-Val-Cit-PABC-NH-Ci8 的制備；
[0024](2)脫 Fmo c 保護(hù)的 Va 1-C i t-PABC-NH-Cis 的制備；
[0025](3)嵌段聚合物 mPEG-Va 1-C i t-PABC-NH_C18 的制備；
[0026](4)合成用于對照研究的不含PABOH的嵌段聚合物mPEG-Val-Cit-NH-C18。
[0027](二)嵌段共聚物納米膠束系統(tǒng)的構(gòu)筑及表征
[0028]用溶劑蒸發(fā)法制備mPEG-Val-Cit-PABC-NH-C18膠束及SN-38載藥膠束，測定其臨界膠束濃度;用透射電鏡(TEM)觀測其形貌，用動態(tài)光散射儀(DLS)測定粒徑大小及分布;用芘熒光探針法測定其臨界膠束濃度;用高效液相色譜測定載藥膠束的包封率和載藥量。
[0029](三)嵌段共聚物納米膠束的降解及釋藥性能
[0030]用DLS追蹤mPEG-Val-Cit-PABC-NH-C18納米膠束在模擬的腫瘤細(xì)胞溶酶體環(huán)境中降解的粒徑變化情況;測定載藥膠束mPEG-Val-Cit-PABC-NH-CidPmPEG-Val-Cit-NH-C^a釋藥性能。
[0031 ](四)載SN-38的mPEG-Val-Cit-PABC-NH-Cis和mPEG-Val-Cit-NH-Cis膠束的細(xì)胞毒性研究
[0032]噻唑藍(lán)(MTT)比色法檢測兩種空白膠束mPEG-Val-Cit-PABC-NH-Cis和mPEG-Val-Cit-NH-C18 對結(jié)腸癌細(xì)胞 HCT-116 的細(xì)胞毒性以及載 SN-38 的 mPEG-Val-Cit-PABC-NH-C^PmPEG-Val-Cit-NH-C18載藥膠束及陽性藥SN-38對結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-116的細(xì)胞毒性。
[0033]本發(fā)明有益效果包括:本發(fā)明所述嵌段聚合物可以用于構(gòu)筑納米膠束，可以增強細(xì)胞內(nèi)的藥物控制釋放，并且在引入PABOH間隔基后具有更好的釋藥性能和較低的細(xì)胞毒性。本發(fā)明所述嵌段聚合物包含親水性的甲氧基聚乙二醇的羧酸衍生物和親脂性的脂肪胺，并通過組織蛋白酶B可降解的二肽Val-Cit及PABOH將其偶聯(lián)，從而制得一種兩親性的嵌段共聚物。本發(fā)明聚合物自組裝形成的納米載藥膠束可實現(xiàn)增強的腫瘤細(xì)胞內(nèi)的藥物控制釋放，細(xì)胞毒性較低，其具有作為疏水性抗腫瘤藥物載體的廣泛應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0034]圖1 為嵌段共聚物 mPEG-Val-Cit-PABC-NH-Cis 和對照物 mPEG-Val-Cit-NH-Cis 的合成路線圖。
[0035]圖2為mPEG-Val-Cit-PABC-NH-Cid^^束的粒徑分布((A)為DLS圖)及形貌圖((B)為TEM 圖)ο
[0036]圖3為mPEG-Val-Cit-PABC-NH-C18膠束在模擬的腫瘤細(xì)胞溶酶體環(huán)境下的粒徑變化圖。
[0037]圖4 為載藥的 mPEG-Val-Cit-PABC-NH-Cis 和 mPEG-Val-Cit-NH-Cis 膠束在模擬的腫瘤細(xì)胞溶酶體環(huán)境下的釋藥速率圖。
[0038]圖5 為載藥的 mPEG-Val-Cit-PABC-NH-Cis 和 mPEG-Val-Cit-NH-Cis 膠束及 SN-38 對HCT-116細(xì)胞的細(xì)胞毒性圖(A)為兩種載藥材料mPEG-Val-Cit-PABC-NH-Cl8和mPEG-Val-Cit-NH-C1MiHCT-1ie細(xì)胞的毒性，(B)為裝載了SN-38的載藥膠束對HCT-116細(xì)胞的細(xì)胞毒性。
【具體實施方式】
[0039]結(jié)合以下具體實施例和附圖，對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明，本發(fā)明的保護(hù)內(nèi)容不局限于以下實施例。在不背離發(fā)明構(gòu)思的精神和范圍下，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠想到的變化和優(yōu)點都被包括在本發(fā)明中，并且以所附的權(quán)利要求書為保護(hù)范圍。實施本發(fā)明的過程、條件、試劑、實驗方法等，除以下專門提及的內(nèi)容之外，均為本領(lǐng)域的普遍知識和公知常識，本發(fā)明沒有特別限制內(nèi)容。
[0040] 實施例1
[0041 ] Fmoc-Val-Cit-PABC-NH-Cn 的制備，η為 18
[0042 ]將Fmoc-Va 1-Ci t-PABC-PNP (11 Omg，0.14mmo I)、硬脂胺(46mg，I.2equ i v)和DMAP(21mg，1.2eqUiv)的混合物溶于20mL二氯甲烷中，氮氣保護(hù)下于室溫攪拌36小時后，濃縮反應(yīng)液后加入30mL乙醚超聲，過濾、干燥得到固體產(chǎn)物98mg，產(chǎn)率為76%。
[0043]實施例2
[0044]脫Fmoc 保護(hù)的 Val-Cit-PABC-NH-Cn 的制備，η為 182
[0045]將Fmoc-Va1-Cit-PABC-NH-Cis (245mg，0.27mmo I)溶于 15mL二甲基