一種固定化單胺氧化酶及其在合成手性氮雜雙環(huán)化合物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種固定化單胺氧化酶，該固定化單胺 氧化酶的制備方法，以及該固定化單胺氧化酶作為催化劑在不對(duì)稱合成手性氮雜雙環(huán)化合 物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 酶是一類由生物體產(chǎn)生的具有催化功能的生物大分子物質(zhì)，作為一種生物催化 劑，酶在常溫常壓的溫和條件下能催化各種有機(jī)化學(xué)反應(yīng)。酶催化具有高效性，比一般催化 劑的效率高出1〇 7~10 13倍；酶催化具有很高的專一性，可以減少或避免副反應(yīng)，得到很高 純度的產(chǎn)物；酶催化反應(yīng)還具有很高的立體選擇性和區(qū)域選擇性，無(wú)需保護(hù)與脫保護(hù)。酶的 這些優(yōu)點(diǎn)大大促進(jìn)了人們對(duì)酶的應(yīng)用和酶技術(shù)的研究。但是，由于酶絕大多數(shù)屬于蛋白質(zhì)， 其高級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)環(huán)境十分敏感，各種因素如物理因素（溫度、壓力、電磁場(chǎng)等）、化學(xué)因素（氧 化、還原、有機(jī)溶劑、金屬離子、離子強(qiáng)度、pH等）和生物因素（酶修飾和酶降解等）均有可 能使其喪失生物活性。即使在最適條件下，酶也會(huì)逐漸失活，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，反應(yīng)速 度會(huì)逐漸下降；此外，反應(yīng)后酶不能回收，只能采用分批法進(jìn)行生產(chǎn)，這對(duì)于現(xiàn)代生物催化 工業(yè)來(lái)說(shuō)，成本較高。
[0003] 為了解決以上問(wèn)題，人們?cè)O(shè)計(jì)了一種固定化酶，就是將酶束縛于某種特殊的介質(zhì) 中，使它與反應(yīng)體系分開(kāi)，但仍能與底物進(jìn)行分子交換。這種固定化酶與一般的固體化學(xué)催 化劑一樣，既具有催化特性，又具有能回收、反復(fù)使用等優(yōu)點(diǎn)，生產(chǎn)工藝也可以實(shí)現(xiàn)連續(xù)化、 自動(dòng)化。
[0004] 固定化酶的固定化方法包括吸附法、包埋法、交聯(lián)法與共價(jià)結(jié)合法。其中，吸附法 又可以分為物理吸附法與離子吸附法兩種，該方法條件溫和，酶活損失少，易于再生，但是 固定得不牢固，非常容易解吸附。包埋法主要采用海藻酸鈣、卡拉膠、聚丙烯酰胺、尼龍膜或 硝酸纖維素微囊包埋，該方法一般較為溫和，酶活性損失少，但是傳質(zhì)阻力很大，不利于較 大分子或很低溶解度底物的催化。交聯(lián)法中用得最多的是戊二醛交聯(lián)，一般操作較為簡(jiǎn)便， 但是反應(yīng)劇烈，酶活損失大；而且機(jī)械性能差，顆粒度細(xì)，難以分離。共價(jià)結(jié)合法常用芳胺載 體的重氮化反應(yīng)、羥基載體的溴化氰-亞胺碳酸鹽反應(yīng)、羧基載體的羰二亞胺反應(yīng)、巰基載 體的二硫鍵交換反應(yīng)等，由于其結(jié)合牢固、穩(wěn)定性好等特點(diǎn)，是目前研究與應(yīng)用最為廣泛的 一類方法。但是該方法條件苛刻，反應(yīng)劇烈，酶活損失大（一般殘余酶活在30%左右）。
[0005] 博昔普韋（boceprevir)及特拉匹韋（telaprevir)是丙型肝炎病毒（HCV)蛋白酶 抑制劑，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下所示：
[0006]
[0007] III期SPRINT-2研究顯示，與標(biāo)準(zhǔn)治療相比，24周的博昔普韋標(biāo)準(zhǔn)治療可提高HCV 基因1型初治患者的SVR率。博昔普韋標(biāo)準(zhǔn)治療24周與博昔普韋標(biāo)準(zhǔn)治療44周的抗病毒 療效相似。片段A是合成博昔普韋的關(guān)鍵中間體之一，片段A的結(jié)構(gòu)如下：
[0008]
[0009] 目前關(guān)于片段A主要有如下合成路線：
[0010] 路線1 :TO2007075790公開(kāi)了利用6, 6-二甲基-3-氧雜雙環(huán)[3. 1. 0]己 烷-2, 4-二酮將內(nèi)酯內(nèi)酰胺化、羰基還原、還原加成氰基、水解、拆分等得到片段A的鹽，具 體反應(yīng)路線如下所示：
[0011]
[0012] 由于此路線中的氰基加成利用了硝酸銀、氰化鉀和鹽酸，成本較高，對(duì)于后處理和 三廢處理也帶來(lái)了很大困難，不利于工業(yè)化生產(chǎn)。
[0013] 路線 2 :文獻(xiàn)（Journal of Medicinal Chemistry, 2006, Vol. 49， No. 20,6074-6086)中公開(kāi)了一種以3-苯基四氫吡咯[l，2-c]惡唑-5 (1H)-酮為原料，經(jīng)過(guò) 去氫、環(huán)丙烷化、開(kāi)環(huán)、還原、氧化等一系列反應(yīng)得到關(guān)鍵片段A，具體反應(yīng)路線如下所示： [00^1
[0015] 由于此路線中的還原反應(yīng)采用了氫化鋰鋁和鈀碳，反應(yīng)條件苛刻，后處理較為繁 瑣，也不利于工業(yè)化生產(chǎn)。
[0016] 路線3 :TO2004113295公開(kāi)了使用6, 6-二甲基-3-氧雜雙環(huán)[3. 1. 0]己 烷-2, 4-二酮為原料，經(jīng)過(guò)醇解、酰胺化、還原酰胺基和酯基、將氨基保護(hù)后氧化醇成醛、成 環(huán)、氰基化、水解、去保護(hù)得到片段A的鹽酸鹽，具體反應(yīng)路線如下：
[001V
[0018] 雖然此路線具有起始原料價(jià)廉易得的優(yōu)點(diǎn)，但該路線在制備（1R，3S)_3-氨甲 基-2, 2-二甲基環(huán)丙烷基甲醇時(shí)需采取二級(jí)還原反應(yīng)，即，首先利用選自鋁烷、在三甲基硅 烷基氯存在下的硼氫化鋰或硼氫化鈉還原酯基，再使用氫化鋁鋰或三乙酰氧基硼氫化鈉還 原酰胺基，上述還原反應(yīng)條件劇烈，溫度要求苛刻，反應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng)，后處理繁瑣，安全性低， 以致影響了該路線的工業(yè)化應(yīng)用。
[0019] 路線 4 :文獻(xiàn)（J. Am. Chem. Soc. 2012, 134, 6467-6472)公開(kāi)了 利用來(lái)自黑曲 霉（Aspergillus niger)的單胺氧化酶的消除-加成反應(yīng)制備（lS，2S，5R)-6, 6-二甲 基-3-氮雜-雙環(huán)[3. 1. 0]己烷-2-腈的方法，如下所示：
[0020]
[0021 ] 該方法通過(guò)單胺氧化酶將前手性的胺氧化為手性亞胺，在NaHS03#在的條件下生 成加成產(chǎn)物；后者與NaCN反應(yīng)得到手性的亞胺加成產(chǎn)物（如上），后者甲醇解得到氨基酸 甲酯鹽酸鹽。該法立體選擇性地構(gòu)建了 3個(gè)手性中心，比化學(xué)方法簡(jiǎn)便、易于操作、對(duì)環(huán)境 友好；但是亞胺產(chǎn)物易揮發(fā)且閃點(diǎn)較低，需要額外加入NaHS03，步驟較為繁瑣。
[0022] 片段B是合成特拉匹韋的關(guān)鍵中間體之一，片段B的結(jié)構(gòu)如下：
[0023]
[0024] 目前關(guān)于片段B的合成路線主要有如下路線：
[0025] 路線1 :EP0600741公開(kāi)了如下路線：
[00°^1
[0027] 由于由該路線合成得到的目標(biāo)物存在于油狀混合物中，需經(jīng)過(guò)硅膠柱層析分離才 能得到純品，不僅后處理繁瑣，而且無(wú)法實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)。
[0028] 路線2 :TO0218369公開(kāi)了如下路線：
[0029]
[0030] 由于該路線采用DIBAL-H還原，不僅試劑成本較高，而且制備條件苛刻（需 在-78°C下反應(yīng)），因此此路線也不適合于工業(yè)化生產(chǎn)要求。
[0031] 路線3 :CN101463001中公開(kāi)了如下路線：
[0032:
[0033] 該路線使用了劇毒的羰基鈷，不僅成本太高，而且無(wú)法滿足環(huán)保要求，因此該路線 也不能滿足產(chǎn)業(yè)化要求。
[0034] 路線4 :W02008090819公開(kāi)了如下路線：
[0035]
[0036] 由于該路線的起始原料難以合成、不能批量購(gòu)得，因此也不適合工業(yè)化生產(chǎn)要求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0037] 本發(fā)明針對(duì)單胺氧化酶在酶催化過(guò)程中分離困難，以及酶固定化過(guò)程中存在的酶 活性損失大或傳質(zhì)困難等問(wèn)題，將商品化的環(huán)氧樹(shù)脂依次用亞胺基二乙酸（IDA)、硫酸鎳進(jìn) 行衍生化，得到酶固定化載體，而后用單胺氧化酶進(jìn)行固定化。該固定化方法反應(yīng)溫和，酶 活基本無(wú)損失。運(yùn)用該固定化酶與氧化劑對(duì)底物前手性化合物氮雜雙環(huán)化合物進(jìn)行氧化反 應(yīng)，然后與MR發(fā)生加成反應(yīng)制備（1S，2S，5R)-氮雜-雙環(huán)化合物，可以重復(fù)利用5批次，且 分離簡(jiǎn)單。
[0038] 本發(fā)明的內(nèi)容之一是提供了一種重組單胺氧化酶，其是由SEQ ID No. 2所示的核 苷酸序列編碼。
[0039] 制備上述的重組單胺氧化酶的方法，包括：將包括SEQ No. 2所示的單胺氧化 酶基因的質(zhì)粒和pET28a載體用同樣的限制性內(nèi)切酶Nde I和Xho I雙酶切，回收雙 酶切片段，經(jīng)T4DNA連接酶連接，形成重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-BYK-MA0N ;將該重組表達(dá) 質(zhì)粒pET28a-BYK-MA0N轉(zhuǎn)化大腸桿菌（E. co 1 i) BL21 (DE3)，即可獲得本發(fā)明的基因工 程菌株，即 E. coliBL21 (DE3)/pET28a-BYK-MA0N ;將基因工程菌株 E. coliBL21 (DE3)/ pET28a-BYK-MA0N接種至含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，當(dāng)培