植酸酶突變體的制作方法
【專利說(shuō)明】
[0001] 本申請(qǐng)要求于2014年11月21日提交中國(guó)專利局、申請(qǐng)?zhí)枮?01410677220. 8、發(fā) 明名稱為"植酸酶突變體"的中國(guó)專利申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)，其全部?jī)?nèi)容通過(guò)引用結(jié)合在本申請(qǐng) 中。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種植酸酶突變體、其制備方法及應(yīng)用、編碼 該植酸酶突變體的DNA分子、載體、宿主細(xì)胞。
【背景技術(shù)】
[0003] 植酸酶是一種能水解植酸的磷酸酶類。它能將植酸磷（六磷酸肌醇）降解為肌 醇和無(wú)機(jī)磷酸。此酶分為兩類：3-植酸酶（EC. 3. 1. 3. 8)和6-植酸酶（EC. 3. 1. 2. 6)。植酸酶廣泛存在于植物、動(dòng)物和微生物中，如玉米、小麥等高等植物，枯草芽孢桿菌、 假單孢桿菌、乳酸桿菌、大腸桿菌等原核微生物及酵母、根霉、曲霉等真核微生物中。
[0004] 在谷物、豆類和油料等作物籽實(shí)中，磷的基本貯存形式是植酸磷，其含量高達(dá) 1 %~3 %，它占植物中總磷的60 %~80 %。但是以植酸磷形式存在的磷卻因單胃動(dòng)物體內(nèi) 缺乏能分解植酸的酶而難以被利用，其利用率僅在0%~40%，從而造成了許多問(wèn)題：首先 是造成磷源浪費(fèi)，一方面飼料中的磷源不能得到有效利用，另一方面為了滿足動(dòng)物對(duì)磷的 需求，又必須在飼料中添加無(wú)機(jī)磷，提高了飼料成本；其次是形成高磷糞便污染環(huán)境。飼料 中85 %左右的植酸磷會(huì)被動(dòng)物直接排出體外，糞便中大量的植酸磷使水和土壤受到嚴(yán)重污 染。另外，植酸磷還是一種抗?fàn)I養(yǎng)因子，它在動(dòng)物胃腸道的消化吸收過(guò)程中會(huì)與多種金屬離 子如冗^(guò)心^以^^等以及蛋白質(zhì)螯合成相應(yīng)的不溶性復(fù)合物-低了動(dòng)物對(duì)這些營(yíng)養(yǎng) 物質(zhì)的有效利用。
[0005] 植酸酶可作為一種單胃動(dòng)物的飼料添加劑，它的飼喂效果已在世界范圍內(nèi)得到了 確證。它可使植物性飼料中磷的利用率提60 %，糞便中磷排泄量減少40 %，同時(shí)還可降低 植酸的抗?fàn)I養(yǎng)作用。因此在飼料中添加植酸酶對(duì)提高畜禽業(yè)生產(chǎn)效益及降低植酸磷對(duì)環(huán)境 的污染有重要意義。
[0006] 現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)的植酸酶主要有來(lái)源于黑曲霉的真菌植酸酶和來(lái)源于大腸桿菌的 細(xì)菌植酸酶兩種。其中來(lái)源于大腸桿菌的植酸酶APPA具有高比活性及良好的消化道穩(wěn)定 性等特點(diǎn)。目前主要通過(guò)在粉末飼料直接添加或顆粒飼料后噴涂的方法應(yīng)用在飼料行業(yè)。 [0007] 因?yàn)槟壳霸陬w粒飼料生產(chǎn)過(guò)程中有一個(gè)短暫的80-90°C的高溫階段。細(xì)菌植酸酶 APPA熱穩(wěn)定性較差，其水溶液在70°C下保溫5分鐘剩余酶活性低于30%，直接添加到動(dòng)物 飼料中進(jìn)行制粒后存留酶活一般低于20%，使APPA植酸酶在顆粒飼料的應(yīng)用受到限制。 采用飼料制粒后植酸酶液體噴涂到飼料上的方法不僅增加設(shè)備投入，而且對(duì)酶制劑的穩(wěn)定 性、飼料中分布均一性都無(wú)法很好的保證。因此，提高植酸酶熱穩(wěn)定性是目前飼料用植酸酶 具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 有鑒于此，本發(fā)明提供一種植酸酶突變體，獲得突變體蛋白，提高其耐熱性，從而 有利于植酸酶在飼料領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。
[0009] 為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：
[0010] 本發(fā)明提供了一種植酸酶突變體，其具有（I )、（ II )所示的氨基酸序列中任意 一個(gè)：
[0011] ( I )與植酸酶的氨基酸序列具有至少70%同源性的序列；
[0012] ( II )具有所述植酸酶的至少一個(gè)免疫表位，且所述植酸酶的氨基酸序列經(jīng)修飾、 取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸獲得的氨基酸序列。
[0013] 在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，植酸酶突變體的氨基酸序列與植酸酶的氨基酸序列具 有至少75 %同源性的序列。
[0014] 在本發(fā)明的另一些實(shí)施例中，植酸酶突變體的氨基酸序列與植酸酶的氨基酸序列 具有至少80 %同源性的序列。
[0015] 在本發(fā)明的另一些實(shí)施例中，植酸酶突變體的氨基酸序列與植酸酶的氨基酸序列 具有至少85 %同源性的序列。
[0016] 在本發(fā)明的另一些實(shí)施例中，植酸酶突變體的氨基酸序列與植酸酶的氨基酸序列 具有至少90 %同源性的序列。
[0017] 在本發(fā)明的另一些實(shí)施例中，植酸酶突變體的氨基酸序列與植酸酶的氨基酸序列 具有至少95 %同源性的序列。
[0018] 在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，所述修飾包括酰胺化、磷酸化、甲基化、乙酰化、泛素 化、糖基化或羰基化。
[0019] 在本發(fā)明的另一些實(shí)施例中，所述取代為取代1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)、7個(gè)、 8個(gè)、9個(gè)、10個(gè)、11個(gè)、12個(gè)、13個(gè)、14個(gè)、15個(gè)、16個(gè)或17個(gè)氨基酸。
[0020] 在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，所述取代為取代12個(gè)、13個(gè)、15、16個(gè)或17個(gè)氨基酸。
[0021] 在本發(fā)明的另一些實(shí)施例中，所述取代為第25位、第46位、第62位、第70位、第 73位、第75位、第114位、第137位、第142位、第146位、第159位或第255位中的一個(gè)或 多個(gè)氨基酸被取代。
[0022] 在本發(fā)明的另一些實(shí)施例中，所述取代為第25位、第46位、第62位、第70位、第 73位、第75位、第114位、第137位、第142位、第146位、第159位或第255位的氨基酸被 取代。
[0023] 在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，所述植酸酶具有如SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列。
[0024] 在本發(fā)明的另一些實(shí)施例中，所述取代為氨基酸序列為SEQ ID NO: 1的植酸酶的 第25位氨基酸由Ala變?yōu)镻he，第46位氨基酸由Trp變?yōu)镚lu，第62位氨基酸由Gin變?yōu)?Trp，第70位氨基酸由Gly變?yōu)镚lu，第73位氨基酸由Ala變?yōu)镻ro，第75位氨基酸由Lys 變?yōu)镃ys，第114位氨基酸由Thr變?yōu)镠is，第137位氨基酸由Asn變?yōu)閂al，第142位氨基 酸由Asp變?yōu)锳rg，第146位氨基酸由Ser變?yōu)镚lu，第159位氨基酸由Arg變?yōu)門yr，第255 位氨基酸由Tyr變?yōu)锳sp。
[0025] 在本發(fā)明的另一些實(shí)施例中，所述取代為第46位、第62位、第70位、第73位、第 75位、第114位、第137位、第142位、第146位、第159位或第255位的氨基酸被取代。
[0026] 在本發(fā)明的另一些實(shí)施例中，所述取代為第46位、第62位、第70位、第73位、第 75位、第137位、第142位、第146位、第159位或第255位的氨基酸被取代。
[0027] 在本發(fā)明的另一些實(shí)施例中，所述取代還包括第380位的氨基酸被取代。
[0028] 在本發(fā)明的另一些實(shí)施例中，所述取代還包括第80位、第176位或第187位中的 一個(gè)或多個(gè)氨基酸被取代。
[0029] 在本發(fā)明的另一些實(shí)施例中，所述取代還包括第161位的氨基酸被取代。
[0030] 本發(fā)明還提供了編碼上述的植酸酶突變體的DNA分子。
[0031] 在本發(fā)明的另一些實(shí)施例中，植酸酶突變體具有如SEQ ID N0:3或SEQ IDN0:5或 SEQIDN0:7或SEQIDN0:9或SEQIDN0:13或SEQIDN0:15所示的氨基酸序列。
[0032] 在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，編碼上述的植酸酶突變體的DNA分子具有如SEQ ID NO:4 或 SEQ ID NO:6 或 SEQ ID NO:8 或 SEQ ID NO:10 或 SEQ ID NO:14 或 SEQ ID NO:16 所示的核苷酸序列。
[0033] 本發(fā)明還提拱了具有上述DNA分子的載體。
[0034] 上述植酸酶突變體的氨基酸序列為SEQ ID N0:3,其一種編碼基因的核酸序列為 SEQ ID N0:4。
[0035] 本發(fā)明還包括攜帶有編碼序列為SEQ ID NO:4的植酸酶突變體基因的質(zhì)粒。
[0036] 在本發(fā)明的另一些實(shí)施例中，所述取代還包括第380位的氨基酸被取代。
[0037] 在本發(fā)明的另一些實(shí)施例中，所述取代還包括將氨基酸序列為SEQ ID N0:3的植 酸酶的第380位氨基酸由Ala變?yōu)镻ro。
[0038] 上述突變體的氨基酸序列為SEQ ID NO: 5,其一種編碼基因的核酸序列為SEQ ID N0:6〇
[0039] 本發(fā)明還包括攜帶有編碼序列為SEQ ID NO:6的植酸酶突變體基因的質(zhì)粒。
[0040] 在本發(fā)明的另一些實(shí)施例中，所述取代還包括第80位、第176位或第187位中的 一個(gè)或多個(gè)氨基酸被取代。
[0041] 在本發(fā)明的另一些實(shí)施例中，氨基酸序列為SEQ ID N0:5的植酸酶的第80位氨基 酸由Ser變?yōu)镻ro,第176位氨基酸由Asn變?yōu)镻ro,第187位氨基酸由Ser變?yōu)镻ro。
[0042] 上述植酸酶突變體的氨基酸序列為SEQ ID N0:7,其一種編碼基因的核酸序列為 SEQ ID N0:8。
[0043] 本發(fā)明還包括攜帶有編碼序列為SEQ ID NO:8的植酸酶突變體基因的質(zhì)粒。
[0044] 在本發(fā)明的另一些實(shí)施例中，所述取代還包括第161位的氨基酸被取代。
[0045] 在本發(fā)明的另一些實(shí)施例中，氨基酸序列為SEQ ID N0:7的植酸酶的第第161位 氨基酸由Thr變?yōu)镻ro。
[0046] 上述植酸酶突變體的氨基酸序列為SEQ ID N0:9,其一種編碼基因的核酸序列為 SEQ ID N0:10〇
[0047] 本發(fā)明還包括攜帶有編碼序列為SEQ ID NO: 10的植酸酶突變體基因的質(zhì)粒。
[0048] 在本發(fā)明的另一些實(shí)施例中，氨基酸序列為SEQ ID N0:9的植酸酶的第25位氨基 酸由Phe變?yōu)锳la。所述植酸酶突變體的氨基酸序列為SEQ ID N0:13,其一種編碼基因的 核酸序列為SEQ ID N0:14。
[0049] 本發(fā)明還包括攜帶有編碼序列為SEQ ID NO: 14的植酸酶突變體基因的質(zhì)粒。
[0050] 在本發(fā)明的另一些實(shí)施例中，氨基酸序列為SEQ ID N0:13的植酸酶的第114位氨 基酸由His變?yōu)門hr。所述植酸酶突變體的氨基酸序列為SEQ ID N0:15,其一種編碼基因 的核酸序列為SEQ ID N0:16。
[0051] 本發(fā)明還包括攜帶有編碼序列為SEQ ID NO: 16的植酸酶突變體基因的質(zhì)粒。
[0052] 本發(fā)明還提供了上述植酸酶突變體的制備方法，包括：
[0053] 步驟1 :獲取編碼具有（I )、（ II )所示的氨基酸序列中任意一個(gè)的DNA分子：
[0054] ( I )與植酸酶的氨基酸序列具有至少70%同源性的序列；
[0055] ( II )具有植酸酶的至少一個(gè)免疫表位，且所述植酸酶的氨基酸序列經(jīng)修飾、取 代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸獲得的氨基酸序列；
[0056] 步驟2 :將步驟1獲得的所述DNA分子與表達(dá)載體融合，構(gòu)建重組表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化 宿主細(xì)胞；
[0057] 步驟3 :誘導(dǎo)含重組表達(dá)載體的宿主細(xì)胞表