脫液進(jìn)行超濾脫鹽，得凝血酶原溶液。加入lmol/L的CaCl 2溶液165mL，使得凝 血酶原溶液中Ca2 +的終濃度為0.07mol/L，常溫常壓下活化凝血酶原3h，得凝血酶溶液 2365mL。采用超濾機(jī)對(duì)凝血酶溶液進(jìn)行濃縮，濃縮約11倍左右，得凝血酶粗溶液200mL，標(biāo)記 為Al〇
[0040] 將200mL粗凝血酶溶液A1上樣到已平衡好的DEAE Sephrose CL-6B離子交換柱，用 pH為5.3、檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖劑濃度為0.02mol/L的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖劑作為基 礎(chǔ)液；用pH為5.3、檸檬酸-磷酸氫二鈉濃度為0.02mol/L的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖劑以及 氯化鈉濃度為lmol/L組成的混合液作為梯度劑；由上述基礎(chǔ)液和梯度洗脫劑針對(duì)層析柱進(jìn) 行梯度洗脫，收集凝血酶活性峰A2,得初步純化的凝血酶洗脫液155mL。
[0041] 將收集的凝血酶洗脫液A2裝于截留分子為3500Da的透析袋中，用含0.2mol/L氯化 鈉，濃度為0.02!11〇1/1，？田直為5.3的乙酸鈉-乙酸緩沖液進(jìn)行透析。然后上樣到已平衡好的 DEAE Sephrose CL-6B離子交換柱，用含0 · 2mol/L氯化鈉，濃度為0 · 02mol，pH值為5 · 3的乙 酸鈉-乙酸緩沖劑作為基礎(chǔ)液；用調(diào)節(jié)pH為5.3,濃度為0.02mol/L的乙酸鈉-乙酸緩沖劑以 及氯化鈉濃度為lmol/L組成的混合液作為梯度劑；由上述基礎(chǔ)液和梯度洗脫劑針對(duì)層析柱 進(jìn)行梯度洗脫，收集凝血酶活性峰A3，得限制性凝血酶洗脫液345mL。
[0042] 將限制性凝血酶溶液A3進(jìn)行超濾脫鹽濃縮，得到72ml限制性凝血酶濃縮液，標(biāo)記 為A4。凍干上述限制性凝血酶濃縮液，即得白色粉末狀限制性凝血酶成品。
[0043] 實(shí)施例2 [0044] 凝血酶的檢測(cè)
[0045] 1、凝血酶效價(jià)以及蛋白濃度檢測(cè)
[0046]按照《中華人民共和國(guó)藥典》2015版二部第1561-1562頁(yè)的有關(guān)凝血酶效價(jià)標(biāo)準(zhǔn)檢 測(cè)方法，作標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)上述實(shí)施案例1中凝血酶溶液六1^2^3)4、進(jìn)行效價(jià)測(cè)定。另外，對(duì) 凝血酶溶液六1^2^3)4進(jìn)行了蛋白濃度的檢測(cè)，測(cè)定方法采用《中國(guó)藥典》2015版四部通 則0731蛋白質(zhì)含量測(cè)定法中的"第二法福林酚法(Lowry法)"，凝血酶效價(jià)及蛋白濃度檢測(cè) 結(jié)果見(jiàn)表1。
[0047] 根據(jù)凝血酶效價(jià)檢測(cè)結(jié)果以及相應(yīng)的蛋白濃度檢測(cè)結(jié)果，計(jì)算凝血酶比活和得 率，其結(jié)果如表2所示。
[0048] 表 1
[0049]
[
[
[0052] 2、凝血酶純度檢測(cè)
[0053] 對(duì)實(shí)施例1制備的限制性凝血酶凍干制劑進(jìn)行純度檢測(cè)，純度測(cè)定方法為《中國(guó)藥 典》2015年版通則0541電泳法中的"第五法SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法"，SDS-PAGE電泳圖 譜見(jiàn)圖2,其中泳道1表示marker，泳道2為sigma凝血酶，泳道3為國(guó)內(nèi)某廠家凝血酶，泳道4 為本發(fā)明實(shí)施例1制備得到的凝血酶。
[0054] 圖2顯示，本發(fā)明所制備的限制性凝血酶呈單一條帶，經(jīng)過(guò)本發(fā)明的精提純化，限 制性凝血酶成品可達(dá)到電泳純。
[0055] 綜上所述，本發(fā)明提供的限制性凝血酶的制備方法的有益效果在于:利用豬血制 備限制性凝血酶，有利于充分利用豬血資源，減少環(huán)境污染;在常溫常壓下即可制備限制性 凝血酶，減少設(shè)備投資；制備得到的限制性凝血酶純度高，可達(dá)到電泳純，可用于酶切GST融 合蛋白；操作簡(jiǎn)單，僅需離心、上樣層析、超濾和凍干等幾個(gè)步驟，容易實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。
[0056] 以上所述僅為本發(fā)明的實(shí)施例，并非因此限制本發(fā)明的專利范圍，凡是利用本發(fā) 明說(shuō)明書(shū)及附圖內(nèi)容所作的等同變換，或直接或間接運(yùn)用在相關(guān)的技術(shù)領(lǐng)域，均同理包括 在本發(fā)明的專利保護(hù)范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 限制性凝血酶的制備方法，其特征在于:包括如下步驟： 步驟1、向新鮮豬血中加入抗凝劑，離心分離，取上清抗凝血衆(zhòng)； 步驟2、將上清抗凝血漿用陰離子交換柱層析，然后用洗脫劑I對(duì)陰離子交換柱進(jìn)行洗 脫，所得洗脫液即為凝血酶原溶液； 步驟3、活化凝血酶原溶液中的凝血酶原，得凝血酶粗溶液； 步驟4、將凝血酶粗溶液進(jìn)行超濾濃縮，得凝血酶濃縮液； 步驟5、將所得的凝血酶濃縮液用陽(yáng)離子交換柱層析，然后用洗脫劑Π 對(duì)陽(yáng)離子交換柱 進(jìn)行洗脫，收集凝血酶蛋白峰，得初步純化的凝血酶溶液； 步驟6、將步驟5所得凝血酶溶液用平衡液進(jìn)行透析； 步驟7、將步驟6所得凝血酶溶液用陽(yáng)離子交換柱層析，然后用洗脫劑m對(duì)陽(yáng)離子交換 柱進(jìn)行洗脫，所得洗脫液即為限制性凝血酶溶液； 步驟8、將限制性凝血酶溶液進(jìn)行超濾脫鹽濃縮，得限制性凝血酶濃縮液； 步驟9、將限制性凝血酶濃縮液凍干，即得白色粉末狀限制性凝血酶成品。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的限制性凝血酶的制備方法，其特征在于:所述抗凝劑為檸檬酸 三鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.8 %的檸檬酸三鈉溶液，所述抗凝劑與血液的體積比為1:7~1:9。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的限制性凝血酶的制備方法，其特征在于:所述步驟3具體為：以 氯化鈣為活化劑，向凝血酶原溶液中加入氯化鈣溶液，使凝血酶原溶液中所含Ca 2+的終濃度 為0.05~0.15mol/L，在常溫常壓下活化1~3小時(shí)得凝血酶粗溶液。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的限制性凝血酶的制備方法，其特征在于:所述洗脫劑I為pH為 7.0、檸檬酸三鈉濃度為0.02mol/L的檸檬酸三鈉溶液。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的限制性凝血酶的制備方法，其特征在于:所述洗脫劑Π 包括第 一基礎(chǔ)液和第一梯度液，所述第一基礎(chǔ)液為pH值5.0~6.0的檸檬酸-磷酸鹽緩沖液，所述第 一基礎(chǔ)液中檸檬酸-磷酸鹽濃度為0.01~0.03mol/L;所述第一梯度液為pH值5.0~6.0的含 有第一離子增強(qiáng)劑的緩沖液，所述第一梯度液中的緩沖劑檸檬酸-磷酸鹽的濃度〇. 〇 1~ 0.03mol/L，所述第一梯度液中第一離子增強(qiáng)劑濃度為0.2~1. Omol/L。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的限制性凝血酶的制備方法，其特征在于:所述洗脫劑m包括第 二基礎(chǔ)液和第二梯度液，所述第二基礎(chǔ)液為pH值為5.0~6.0的醋酸鈉-醋酸緩沖液，所述第 二基礎(chǔ)液中醋酸鈉-醋酸的濃度為0.01~0.03mol/L，所述第二梯度液為pH值5.0~6.0的含 有離子增強(qiáng)劑的緩沖液，所述第二梯度液中的緩沖劑乙酸鈉-乙酸的濃度為〇 . 〇 1~ 0.03mol/L，所述第二梯度液中第二離子增強(qiáng)劑的濃度為0.2~1. Omol/L。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的限制性凝血酶的制備方法，其特征在于:所述平衡液為含有氯 化鈉的緩沖液，所述平衡液的pH為5.0~6.0，所述平衡液中的緩沖劑乙酸-乙酸鈉濃度為 0·01~0·03mol/L。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的限制性凝血酶的制備方法，其特征在于:所述陰離子交換柱為 DEAE Sepharose Fast Flow陰離子交換柱。9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的限制性凝血酶的制備方法，其特征在于:所述陽(yáng)離子交換柱為 DEAE Sephrose CL-6B陽(yáng)離子交換柱。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種純度高、比活高的限制性凝血酶的制備方法，利用陰離子交換層析介質(zhì)從豬血漿中吸附凝血酶原，對(duì)陰離子層析柱進(jìn)行洗脫，活化凝血酶原，得凝血酶粗溶液，經(jīng)超濾濃縮，得凝血酶濃縮液，再用陽(yáng)離子交換層析介質(zhì)吸附凝血酶，對(duì)陽(yáng)離子層析柱進(jìn)行洗脫，得凝血酶溶液，經(jīng)超濾脫鹽濃縮，最后凍干得限制性凝血酶成品。本發(fā)明的有益效果在于：利用豬血制備限制性凝血酶，有利于充分利用豬血資源，減少環(huán)境污染；在常溫常壓下即可制備限制性凝血酶，減少設(shè)備投資；制備得到的限制性凝血酶純度高，可達(dá)到電泳純，可用于酶切GST融合蛋白；操作簡(jiǎn)單，僅需離心、上樣層析、超濾和凍干等幾個(gè)步驟，容易實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。
【IPC分類】C12N9/74
【公開(kāi)號(hào)】CN105624134
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610107662
【發(fā)明人】黃宏寶, 黃發(fā)燦, 鄭登忠, 郭曉乾, 章麗麗
【申請(qǐng)人】福建華燦制藥有限公司
【公開(kāi)日】2016年6月1日
【申請(qǐng)日】2016年2月26日