%的水溶液，取100mL加熱至沸騰，攪動(dòng)下準(zhǔn)確加入1. OmL的1 %檸檬酸三鈉水溶 液，繼續(xù)加熱煮沸15min。此時(shí)可觀察到淡黃色的氯金酸水溶液在檸檬酸鈉加入后很快變灰 色，續(xù)而轉(zhuǎn)成黑色，隨后逐漸穩(wěn)定成紅色。冷卻至室溫后用蒸餾水恢復(fù)至原體積。
[0170] 4. 2.膠體金KET-BSA結(jié)合物復(fù)合物的制備
[0171] 膠體金標(biāo)記氯胺酮完全抗原（KET-BSA)的制備：取已制備的膠體金100.0 mL，用 0· lmol/L K2C03將膠體金溶液調(diào)至pH 9. 0,在磁力快速攪拌下迅速加入1. 0~2. Omg氯胺 酮-BSA，攪拌10min后加入1. OmL的10 %的牛血清白蛋白，再繼續(xù)攪拌10min。用高速冷凍 離心機(jī)于4°C、12000rpm/min下離心30min，吸去上清液，沉淀即為膠體金KET-BSA結(jié)合物。 用0. 01m〇l/L、pH 8. 2Tris-HCl緩沖液稀釋至一定濃度后，均勻的浸在玻璃纖維膜上，37°C 干燥備用。
[0172] 4. 3層析測(cè)試條的制備
[0173] 依次將樣品墊膜、玻璃纖維（固相的膠體金KET-BSA結(jié)合物）、硝酸纖維薄膜和樣 品墊粘貼于PVC支持材料上。在硝酸纖維素膜上用點(diǎn)膜機(jī)分別劃?rùn)z測(cè)線和質(zhì)控線，檢測(cè)線 為氯胺酮核酸適體（SEQ ID N0. :1、2、3或4,0.8mg/mL)，質(zhì)控線（C線）為鼠抗BSA單抗 (1. 0mg/mL)，干燥后以封閉液1% 0VA (卵清蛋白）0· 01m〇l/L PBS封閉2小時(shí)；用0· Olmol/ L PBS洗滌3次，真空干燥后切成0. 4cmX 6. 0cm的測(cè)試條。
[0174] 4. 4試劑盒的組裝
[0175] 將上述免疫層析測(cè)試條置于塑料盒內(nèi)，加樣孔對(duì)準(zhǔn)檢測(cè)條樣品墊位置，壓緊后組 裝成氯胺酮檢測(cè)試劑盒，加入干燥劑密封保存。
[0176] 4. 5檢測(cè)盒檢測(cè)原理
[0177] 如圖6所示，本實(shí)施例主要采用核酸適體和層流檢測(cè)技術(shù)。即尿樣中的氯胺酮與 膠體金標(biāo)記的（KET-BSA)競(jìng)爭(zhēng)性地與固相于硝酸纖維膜上的氯胺酮核酸適體結(jié)合，通過觀 察窗檢測(cè)區(qū)（T)位置有無(wú)紫紅色帶進(jìn)行判斷檢測(cè)結(jié)果。無(wú)論樣品中有無(wú)氯胺酮成分，膠體 金標(biāo)記的（KET-BSA)都會(huì)與質(zhì)控區(qū)抗BSA抗體相結(jié)合，形成一條C線。
[0178] 4. 6結(jié)果判斷
[0179] 從密封袋中取出試劑盒，用塑料吸管垂直滴加3滴樣本（尿樣、唾液、血樣等約 120 μ 1)于加樣孔內(nèi)，在5分鐘時(shí)間內(nèi)讀取檢測(cè)結(jié)果（見圖6)。
[0180] 陽(yáng)性（+):僅在質(zhì)控區(qū)（C)出現(xiàn)一條紫紅色帶，在檢測(cè)區(qū)"Τ"位置均未出現(xiàn)紫紅色 帶，說明氯胺酮為陽(yáng)性。陽(yáng)性結(jié)果表明：樣品中氯胺酮濃度均在檢測(cè)閾值之上。
[0181] 陰性:如在質(zhì)控區(qū)（C)出現(xiàn)一條紫紅色帶，僅在檢測(cè)區(qū)"Τ"出現(xiàn)的紫紅色帶， 說明氯胺酮為陰性。陰性結(jié)果表明：氯胺酮濃度均在檢測(cè)閾值之下。檢測(cè)區(qū)（Τ)的紫紅色 帶可顯現(xiàn)出顏色深淺的現(xiàn)象，在規(guī)定的觀察時(shí)間內(nèi)，無(wú)論該色帶顏色深淺，應(yīng)判定為陰性結(jié) 果。陰性結(jié)果表明：氯胺酮濃度均在檢測(cè)閾值之下。
[0182] 無(wú)效：本設(shè)計(jì)的質(zhì)控區(qū)（C)有兩個(gè)目的，一是無(wú)論樣本中是否含有毒品成分，膠體 金標(biāo)記的（KET-BSA)總能與固相于質(zhì)控區(qū)（C)硝酸纖維素膜上的鼠抗BSA抗體結(jié)合，在質(zhì) 控區(qū)（C)處形成一條紫紅色帶，該色帶是樣本陽(yáng)性或陰性的指示線。二是指示檢測(cè)過程是 否正常和試劑盒是否變質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)。若質(zhì)控區(qū)（C)沒有出現(xiàn)色帶，無(wú)論Τ線位置是否出現(xiàn)色 帶，檢測(cè)結(jié)果均為無(wú)效，應(yīng)重新?lián)Q取試劑盒檢測(cè)。
[0183] 實(shí)施例5核酸適體的特異性
[0184] 5. 1選用的交叉反應(yīng)物質(zhì)為美沙酮、美沙芬、甲基苯丙胺、苯丙胺、MDMA、MDA、嗎 啡、可待因、海洛因、福爾可定、單乙酰嗎啡、二氫可待因、二氫埃托菲、雷米替丁、哌替啶、芬 太尼、曲馬多、右丙氧芬、納洛酮、納曲酮、烯丙嗎啡、可樂寧、洛非西丁、東莨菪堿、益安口服 液、正通寧片、撲熱息痛、阿斯匹林、布洛芬、阿米替林、丙米嗪、氯丙嗪、異丙嗪、水合氯醛、 安定、三唑侖、阿普唑侖、苯巴比妥、速可眠、異戊巴比妥、咖啡因、氟哌酸、先鋒IV、黃連素、 乳糖、普魯卡因、康復(fù)新膠囊、水合氯醛、奧復(fù)沙星、非那西丁、去痛片、可卡因、度冷丁、麻黃 素、左旋麻黃素、右旋麻黃素、蒂巴因、四氫大麻酚、利多卡因、那可丁、丁丙諾啡、苯丙醇胺 和苯乙胺。
[0185] 將上述檢測(cè)物質(zhì)配制成一定濃度的溶液，用實(shí)施例4所述的試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。
[0186] 結(jié)果表明：核酸適體檢測(cè)試劑（SEQ ID N0. : 1-4中每一種）都僅與氯胺酮發(fā)生 反應(yīng)，與其他物質(zhì)沒有交叉反應(yīng)，氯胺酮核酸適體檢測(cè)試劑盒具有特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確可靠的性 能。之后再進(jìn)行Kd值的檢測(cè)。
[0187] 5. 2由于氯胺酮與美沙酮、美沙芬的交叉反應(yīng)最常見，因此進(jìn)一步利用競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合 法檢測(cè)在美沙酮和美沙芬存在下，SEQ ID NOs. : 1-4的特異性，結(jié)果顯示（圖3)，可見在美 沙酮、美沙芬的存在下不會(huì)影響適體對(duì)氯胺酮的檢測(cè)，具有很強(qiáng)的特異性。
[0188] Kd 值用 GraphPad Prism 6. 0 擬合計(jì)算得到，Apt#8、Apt#4 的 Kd 值分別為 0· 66 μ Μ 和0. 59 μ Μ(圖4)。目前，針對(duì)小分子篩選得到的適體Kd值一般在1-10 μ Μ，而本發(fā)明適體 的Kd值達(dá)到了亞微摩爾級(jí)，實(shí)現(xiàn)了重大的突破。
[0189] 實(shí)施例6
[0190] 核酸適體的靈敏度
[0191] 靈敏度測(cè)試：在空白尿樣中添加氯胺酮，分別配制成一系列梯度濃度（1.0~ 2000.0 ng/mL)的溶液來測(cè)試氯胺酮試劑盒。
[0192] 結(jié)果顯示本發(fā)明核酸適體的氯胺酮的最低檢測(cè)靈敏度均為10.0 ng/mL以下。此 外，SEQ ID NO. :1-2所示的適體則達(dá)到了 l-5ng/ml，可見在極低濃度下，本發(fā)明核酸適體也 能靈敏地檢出氯胺酮。與膠體金標(biāo)記氯胺酮單克隆抗體的免疫檢測(cè)試劑盒相比，其靈敏度 高出至少10-20倍。
[0193] 上述試驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明首次建立了可用于篩選特異性識(shí)別毒品、毒物小分子 的DNA適體的篩選平臺(tái)，并成功研發(fā)出對(duì)氯胺酮有非常高特異性和親和力的核酸適體。本 發(fā)明核酸適體與其它藥物、毒品，尤其是美沙酮和美沙芬不發(fā)生任何交叉反應(yīng)，證實(shí)了核酸 適體具有高度的特異性。本發(fā)明提供的核酸適體和檢測(cè)試劑盒比單克隆抗體的檢測(cè)的靈敏 度要高出至少10-20倍，此外，本發(fā)明特異性、穩(wěn)定性、快速檢測(cè)和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)等方面，也具有 顯著的技術(shù)優(yōu)點(diǎn)。
[0194] 由于本發(fā)明具有重復(fù)性好、無(wú)批次間差異等特點(diǎn)，因此在毒品、毒物的檢測(cè)方面具 有廣闊的前景。
[0195] 在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú) 引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可 以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范 圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種核酸適體，其特征在于，所述的適體特異性結(jié)合于氯胺酮； 并且，所述的特異性結(jié)合指所述適體結(jié)合于氯胺酮但不結(jié)合于以下任何一種物質(zhì)：美 沙酮、美沙芬、甲基苯丙胺、苯丙胺、MDMA、MDA、嗎啡、可待因、海洛因、福爾可定、單乙酰嗎 啡、二氫可待因、二氫埃托菲、雷米替丁、哌替啶、芬太尼、曲馬多、右丙氧芬、納洛酮、納曲 酮、烯丙嗎啡、可樂寧、洛非西丁、東莨菪堿、益安口服液、正通寧片、撲熱息痛、阿斯匹林、布 洛芬、阿米替林、丙米嗪、氯丙嗪、異丙嗪、水合氯醛、安定、三唑侖、阿普唑侖、苯巴比妥、速 可眠、異戊巴比妥、咖啡因、氟哌酸、先鋒IV、黃連素、乳糖、普魯卡因、康復(fù)新膠囊、水合氯 醛、奧復(fù)沙星、非那西丁、去痛片、可卡因、度冷丁、麻黃素、左旋麻黃素、右旋麻黃素、蒂巴 因、四氫大麻酚、利多卡因、那可丁、丁丙諾啡、苯丙醇胺或苯乙胺。2. 如權(quán)利要求1所述的核酸適體，其特征在于，所述的適體的序列如SEQ ID NO. :1、2、 3、或4所示。3. -種偶聯(lián)物，其特征在于，所述偶聯(lián)物包括權(quán)利要求1所述的核酸適體以及與所述 核酸適體相連的可檢測(cè)標(biāo)記物。4. 如權(quán)利要求3所述的偶聯(lián)物，其特征在于，所述的可檢測(cè)標(biāo)記物包括生物素、化學(xué)發(fā) 光基團(tuán)、化學(xué)熒光基團(tuán)、熒光蛋白、酶、膠體金、放射性同位素、乳膠顆粒、抗體、配體、抗原、 受體、或其組合。5. -種復(fù)合物，其特征在于，所述的復(fù)合物是（a)權(quán)利要求1所述的核酸適體或權(quán)利要 求3所述的偶聯(lián)物與（b)氯胺酮所形成的復(fù)合物。6. -種檢測(cè)制品，其特征在于，所述檢測(cè)制品含有權(quán)利要求1所述的核酸適體或權(quán)利 要求3所述的偶聯(lián)物。7. 如權(quán)利要求6所述的檢測(cè)制品，其特征在于，所述的檢測(cè)制品包括：檢測(cè)試劑、側(cè)流 片、芯片、測(cè)試條、檢測(cè)板。8. -種檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述檢測(cè)試劑盒包含權(quán)利要求1所述的核酸適體，權(quán) 利要求3所述的偶聯(lián)物和/或權(quán)利要求6所述的檢測(cè)制品。9. 如權(quán)利要求1所述的核酸適體或權(quán)利要求3所述偶聯(lián)物的用途，其特征在于，用于制 備檢測(cè)氯胺酮的檢測(cè)制品或試劑盒。10. -種檢測(cè)氯胺酮的方法，包括以下步驟： (a) 提供待檢測(cè)的樣品； (b) 將該樣品與權(quán)利要求1所述的核酸適體或權(quán)利要求3所述的偶聯(lián)物混合，形成混合 物； (c) 檢測(cè)所述混合物中"氯胺酮-核酸適體復(fù)合物"的存在與否，其中如果存在所述復(fù) 合物，則表明所述樣品中存在氯胺酮；如果不存在所述復(fù)合物，則表明所述樣品中不存在氯 胺酮。
【專利摘要】本發(fā)明提供了氯胺酮核酸適體、檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用。具體地，本發(fā)明人采用SELEX技術(shù)，基于特殊結(jié)構(gòu)的ssDNA文庫(kù)，成功地篩選得到對(duì)氯胺酮有高親和力和特異性的核酸適體。本發(fā)明的適體可應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)快速、靈敏地檢測(cè)氯胺酮。
【IPC分類】G01N33/94, C12N15/115
【公開號(hào)】CN105624164
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410609268
【發(fā)明人】曾立波, 張玉榮, 胡小龍, 陳連康, 孫美琪
【申請(qǐng)人】上海市刑事科學(xué)技術(shù)研究院
【公開日】2016年6月1日
【申請(qǐng)日】2014年10月31日