一種生產(chǎn)脂肪端烯的系統(tǒng)及其應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物能源與合成生物學領域，具體而言是一種生物合成生產(chǎn)脂肪端烯 的系統(tǒng)及其應用。
【背景技術】
[0002] 石油、煤炭等化石燃料資源的快速消耗和不可再生性帶來了諸如油價高企、能源 緊缺、環(huán)境污染等一系列問題。在可持續(xù)發(fā)展和節(jié)能減排的大背景下，借助合成生物學方 法，利用基因工程、酶工程和代謝工程手段，大規(guī)模生產(chǎn)可替代化石燃料的可再生生物燃料 勢在必行。在生物燃料中，中長鏈脂肪烴具有與傳統(tǒng)液體化石燃料最為接近的物理化學性 質(zhì)，是最理想的替代燃料。因此，利用生物方法實現(xiàn)脂肪烴的合成具有重要意義。
[0003] 在生物體中，脂肪烴主要來自于脂肪酸代謝途徑。脂肪酸作為生物體內(nèi)細胞膜的 基本組成成分和主要儲能物質(zhì)，在生物體內(nèi)含量十分豐富。典型的脂肪酸含有長度為c 4-c24 的烷烴側鏈（McEwen and Atsumi 2012)，具備高能量密度和疏水性的特點。利用脂肪烴生 物合成途徑將二氧化碳或葡萄糖等碳源轉(zhuǎn)化成能夠直接利用的脂肪烴，是一種極具潛力的 方法。
[0004] 近年來，不同生物體中基于脂肪酸代謝的脂肪烴生物合成途徑的闡明為脂肪烴的 異源高效合成提供了可能。目前已經(jīng)鑒定了五條脂肪烴的生物合成途徑：（1)存在于真核 生物中的脂酰輔酶A還原酶-脂肪醛脫羰基酶途徑（ACR-ADC途徑）（Aarts，Kei jzer et al. 1995, Reed, Quilici et al. 1995, Bourdenx, Bernard et al. 2011，Qiu，Tittiger et al.2012) ;(2)存在于藤黃微球菌，由OleA催化的長鏈脂肪烴生物合成途徑（Beller，Goh et al. 2010) ;(3)存在于大多數(shù)藍細菌中的脂酰ACP還原酶-脂肪醛去甲酰加氧酶途徑 (AAR-AD0 途徑）（Schirmer，Rude et al.2010);(4)存在于藍細菌聚球藻 PCC7002 中的生 產(chǎn)含有末端雙鍵脂肪經(jīng)的"0LS聚酮合成酶"途徑（Mendez_Perez，Begemann et al.2011);
[5] 存在于咸海鮮球菌的P450脂肪酸脫羧酶01eT;E催化的脂肪酸脫羧生成脂肪端烯的途徑 (Rude，Baron et al. 2011)。該途徑由脂肪酸底物一步脫羧生成端烯，是最為簡單直接的脂 肪烴生物合成途徑。
[0005] 自然界中的產(chǎn)烴微生物雖具備脂肪烴的天然合成途徑（Beller，Goh et al· 2010, Mendez-Perez, Begemann et al· 2011，Rude, Baron et al· 2011)，但對其認識有限 且缺乏相應的基因改造工具，因此天然產(chǎn)烴微生物并不具備工業(yè)應用潛力。而目前被廣泛 應用于合成生物學研究和工業(yè)生產(chǎn)的一些模式微生物，具有遺傳背景清晰，生物工程技術 手段成熟等特點，相較之下是構建脂肪烴生物合成系統(tǒng)的優(yōu)勢異源宿主。將天然脂肪烴生 物合成途徑應用于具有工業(yè)開發(fā)潛力的異源微生物中合成脂肪烴極具工業(yè)應用價值。
[0006] 模式生物大腸桿菌基因操作技術成熟，易于代謝改造，倍增時間短，易于大規(guī)模 發(fā)酵培養(yǎng)（Clomburg and Gonzalez 2010, Handke, Lynch et al· 2011，Tee, Chowdhury et al. 2014)。此外，其脂肪酸代謝途徑、調(diào)控機制研究比較透徹，目前已取得的最高脂肪酸產(chǎn) 量為8.6g/L(Xu，Gu et al.2013)，是作為脂肪酸途徑出發(fā)的脂肪烴生物合成研究和開發(fā)的 理想宿主。隨著基因工程、代謝工程及合成生物學的發(fā)展，將上述報道的脂肪烴天然合成途 徑引入大腸桿菌，已成功檢測到多種脂肪烴的合成，表現(xiàn)出良好的應用前景。
[0007] 然而，目前對脂肪烴的生物合成研發(fā)多集中于AAR-AD0途徑（Choi and Lee2013，Harger，Zheng et al.2013)或 CAR-ADO 途徑（Akhtar, Turner et al. 2013, Kallio, Pasztor et al. 2014)，均為先合成脂肪酸，再進一步由脂肪酸合成脂肪 烷烴，合成途徑復雜，脂肪烴合成效率較低。
[0008] 模式光合生物藍細菌屬于原核微生物，細胞結構相對簡單，培養(yǎng)方便，營養(yǎng)要求 低，遺傳背景清晰，遺傳操作技術平臺已經(jīng)相當成熟，細胞內(nèi)生化代謝途徑及其調(diào)控機制也 日趨完善。作為一種光能自養(yǎng)微生物，藍細菌可以利用二氧化碳作為唯一碳源進行自養(yǎng)生 長，不需耗費其它能源，不需要發(fā)酵外源生物質(zhì)。上述脂肪烴合成途徑中有兩種都天然存在 于藍細菌中，使得藍細菌成為一個開發(fā)脂肪烴合成的另一理想宿主。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的在于提供一種生產(chǎn)脂肪端烯的系統(tǒng)及其應用。
[0010] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術方案為：
[0011] -種生產(chǎn)脂肪端烯的系統(tǒng)，系統(tǒng)包含脂肪端烯合成元件、脂肪酸高產(chǎn)元件和還原 伴侶蛋白；
[0012] 或，系統(tǒng)包含脂肪端烯合成元件、脂肪酸高產(chǎn)元件、還原伴侶蛋白和胞內(nèi)過氧化氫 水平調(diào)控元件。
[0013] 所述的脂肪端烯合成元件為來源于鮮咸海鮮球菌（Jeotgalicoccus sp. )ATCC 8456菌株的P450脂肪酸脫羧酶01eT;E或其功能等同體。
[0014] 所述脂肪端烯合成基因為P450脂肪酸脫羧酶基因 oleT:E和/或融合來源于紅球 菌（Rhodococcus sp. )Ν(ΠΜΒ 9784的P450還原伴侶蛋白RhFRED編碼基因的脂肪酸脫羧酶 基因 oleTJE-RhFRED。
[0015] 所述的脂肪酸高產(chǎn)元件為來源于大腸桿菌的硫酯酶' tesA基因、硫酯酶' tesA基 因功能等同體的過表達載體、乙酰輔酶A羧化酶基因 accBCDA、accBCDA功能等同體的過表 達載體、脂肪酸代謝調(diào)控基因 fadR、fadR功能等同體的過表達載體、脂酰輔酶A合成酶基因 fadD、fadD功能等同體基因敲除的宿主菌株、脂酰輔酶A脫氫酶基因 fadE、fadE功能等同 體基因敲除的宿主菌株、來源于藍細菌的脂酰ACP合成酶基因 slrl609基因、slrl609基因 功能等同體基因敲除的宿主菌株中的一種或幾種。
[0016] 所述的P450還原伴侶蛋白為來源于紅球菌（Rhodococcus sp. )NCIMB 9784 P450還原伴侶蛋白RhFRED、不同宿主來源的flavodoxin和flavodoxin reductase、或 ferredoxin和ferredoxin reductase及上述相應的功能等同體中的一種或幾種。
[0017] 所述的胞內(nèi)過氧化氫水平調(diào)控元件為〇XyR調(diào)控基因敲除的宿主菌株。
[0018] -種生產(chǎn)脂肪端烯的系統(tǒng)用于生產(chǎn)脂肪端烯的應用。
[0019] -種生產(chǎn)脂肪端烯的化能異養(yǎng)微生物，異養(yǎng)微生物攜帶所述生產(chǎn)脂肪端烯的系 統(tǒng)。所述的微生物為大腸桿菌、芽孢桿菌、鏈霉菌、酵母或絲狀真菌。
[0020] 進一步的說，所述化能異養(yǎng)微生物的基因組DNA或質(zhì)粒DNA中包含所述系統(tǒng)的核 酸序列中的一種或多種。
[0021] 更進一步的說，所述的異養(yǎng)微生物含有質(zhì)粒pET28b-〇leTIE、pBAD33_' tesA和質(zhì)粒 pFN476-acCBCDA，以及含有脂酰輔酶A合成酶基因 fadD或脂酰輔酶A脫氫酶基因 fadE和 胞內(nèi)過氧化氫水平調(diào)控元件oxyR雙敲除的大腸桿菌；所述的質(zhì)粒pET28b-〇leTIE啟動子為 T7啟動子，復制子為pBR322復制子，包含oleT;E基因；所述的質(zhì)粒pBAD33-' tesA啟動子為 PBAD啟動子，復制子為pl5A復制子，包含' tesA基因；所述的質(zhì)粒pFN476-acCBCDA啟動子 為T7啟動子，復制子為pSClOl復制子，包含accBCDA基因。
[0022] -種所述的生產(chǎn)脂肪端烯的化能異養(yǎng)微生物用于生產(chǎn)脂肪端烯的應用。
[0023] -種生產(chǎn)脂肪端烯的光能自養(yǎng)微生物，光能自養(yǎng)微生物攜帶所述生產(chǎn)脂肪端烯的 系統(tǒng)或系統(tǒng)中至少一個元件。所述的微生物為藍細菌或真核微藻。
[0024] 進一步的說，所述光能自養(yǎng)微生物的基因組DNA中包含所述系統(tǒng)或系統(tǒng)中元件的 核酸序列中的一種或多種。
[0025] 更進一步的說，所述光能自養(yǎng)微生物為基因組中整合了基因 oleT;E、accBCDA基 因，且含有脂酰-ACP合成酶基因 aas敲除的藍細菌菌株。所述的基因 oleT;E整合在基因 slrl609位點，啟動子為PAA啟動子，終止子為TA。終止子；所述的基因 accBCDA整合在基 因 slr0168位點，啟動子為啟動子，終止子為I；b。終止子；
[0026] 或，所述的微生物為基因組中整合了基因 oleT;E-RhFRED、accBCDA基因，且含有脂 酰-ACP合成酶基因 aas敲除的藍細菌菌株。所述的基因 oleT;E-RhFRED整合在基因 slrl609 位點，啟動子為啟動子，終止子為T&終止子；所述的基因 accBCDA整合在基因 slr0168 位點，啟動子為啟動子，終止子為?λ。終止子。
[0027] -種所述的生產(chǎn)脂肪端烯的光能自養(yǎng)微生物用于生產(chǎn)脂肪端烯的應用。
[0028] 所述的脂肪端烯合成元件在化能異養(yǎng)微生物中優(yōu)選為來源于鮮咸海鮮球菌 (Jeotgalicoccus sp.)ATCC 8456菌株的P450脂肪酸脫羧酶oleT;E基因（例如參見NCBI ID:HQ709266. 1)；
[0029] 所述的還原伴侶蛋白基因在化能異養(yǎng)微生物中，優(yōu)選為來源于大腸桿菌的 flavodoxin 和 flavodoxin reductase 基因（例如參見 NCBI ID:CP001509.3);
[0030] 所述的脂肪酸合成元件在化能異養(yǎng)微生物中優(yōu)選為包括來源于大腸桿菌的硫酯 酶'tesA基因（例如參見NCBI ID:CP001509. 3)的過表達載體、乙酰輔酶A羧化酶基因 accBCDA (例如參見NCBI ID:CP001509. 3)的過表達載體、脂肪酸代謝調(diào)控基因 fadR(例如 參見NCBI ID:CP001509. 3)的過表達載體在內(nèi)的脂酰輔酶A合成酶基因 fadD(例如參見 NCBI ID:CP001509.3)敲除菌株；
[0031] 在光合自養(yǎng)微生物中優(yōu)選為過表達藍細菌乙酰輔酶A羧化酶基因 accBCDA(例如 參見NCBI ID:NC_0009