鍵的腫瘤迀移調(diào)控因子，它在TGFi3 1誘導(dǎo)時上調(diào)12'13。我們 發(fā)現(xiàn)miR-122介導(dǎo)的TGFi3 1/TGF0 R1的改變對人和小鼠的血管生成具有明顯的影響（圖 17)。這些體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明miR-122介導(dǎo)的TGFi3 1/TGF0 R1的活性能夠在人和小鼠細(xì)胞 內(nèi)產(chǎn)生明顯的迀移相關(guān)活性。
[0016] 然后我們檢測了降低miR-122對體內(nèi)肝癌的發(fā)展的影響，首先使用人源腫瘤移 植或者小鼠同源的腫瘤，然后使用臨床樣本和小鼠的肝癌模型進(jìn)行研究。使用人或者小 鼠的肝癌細(xì)胞植入到小鼠體內(nèi)形成腫瘤模型，比較腫瘤的大小和迀移狀態(tài)。將IfepG2-NC， HpeG2-122和Η印G2-122-TGFi3 1三種穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的人細(xì)胞系皮下注射到裸小鼠體內(nèi)，5周之 后，處理小鼠并對腫瘤稱重。HepG2-122組小鼠的腫瘤重量和大小相對于其他組有明顯的降 低（圖4a，圖18)。然后我們使用⑶31染色檢測新生血管的數(shù)量，發(fā)現(xiàn)在！fepG2-122組的 腫瘤新生血管數(shù)量降低了 4倍（圖4b，圖13)。當(dāng)在Η印G2-122細(xì)胞過表達(dá)TGF β 1時，月中 瘤重量和新生血管數(shù)量的降低幅度都受到了影響（圖4a和4b)。同樣地，我們研究了在異 源或同源移植的腫瘤中miR-122對局部侵襲和遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的影響。我們發(fā)現(xiàn)表達(dá)miR-122的 腫瘤形狀緊密并且沒有侵襲現(xiàn)象（圖4c)。肺部檢查時發(fā)現(xiàn)，在全部的對照組小鼠中都出現(xiàn) 了迀移囊腫（7/7)，但是在注射Η印G2-122細(xì)胞的小鼠中卻沒有發(fā)現(xiàn)（0/7)(圖4d)。而注 射Η印G2-122-TGFf3 1細(xì)胞組過表達(dá)TGFI3 1，顛倒了 miR-122的對于局部侵襲和遠(yuǎn)端迀移的 作用。然后我們將ifepal-6-NC和過表達(dá)miR-122海綿的Η印al-6兩組細(xì)胞皮下注射到裸 小鼠體內(nèi)，檢測這些小鼠體內(nèi)腫瘤的重量、新生血管的狀態(tài)、侵襲和轉(zhuǎn)移情況。盡管在過表 達(dá)miR-122海綿的Η印al-6組的腫瘤重量有輕微的增加，但是在其他特征方面兩個組沒有 明顯區(qū)別（圖4a-4d，圖19b)。
[0017] 然后我們分別檢測了人和小鼠肝癌樣本中miRNA-122、TGF β 1和TGF β R1的表達(dá) 量。定量分析結(jié)果表明人肝癌樣本中miR-122的表達(dá)量比正常的癌旁組織低了 10倍（圖 4e)。蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)顯示肝癌樣本中的TGFP 1上調(diào)了接近4倍，但是TGFP R1的表達(dá)量 卻沒有發(fā)生變化（圖4f)。我們研究肝臟組織的樣本的血管生長情況發(fā)現(xiàn)，癌癥組織樣本中 的新生血管數(shù)量比正常樣本上升了 6倍（圖4g)。有文獻(xiàn)報道肝臟出現(xiàn)侵襲現(xiàn)象時伴隨著 miR-122的抑制ia4。為了研究肝癌的迀移是否與miR-122、TGFi3 1或者TGFi3 R1的表達(dá)量 相關(guān)，我們分析了原發(fā)性肝癌中基因的表達(dá)數(shù)據(jù)集和相對應(yīng)的疾病注釋15 17,通過處理之后 發(fā)現(xiàn)，miR-122低表達(dá)與低生存率相關(guān)（圖4h)。TGFi3 1高表達(dá)組比低表達(dá)組具有更低的 生存期，5年后存活下來的患者中有70%低表達(dá)TGF0 1，而高表達(dá)TGFi3 1的患者中有超過 50%的人會在這段時間內(nèi)死亡（圖4i)。結(jié)合我們的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果，TGF0R1與生存期并不 直接相關(guān)（圖20)。
[0018] 使用文獻(xiàn)中報道過的方法18獲得了 8只表達(dá)敲入HBx基因的小鼠。檢測miR-122、 TGF0 1和TGF0R1的表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，在腫瘤樣本中miR-122表達(dá)量下降了 8倍，同時TGF0R1 的表達(dá)量上升了 8倍（圖4e，4f)，然而TGF β 1的表達(dá)量卻沒有發(fā)生變化。盡管在這些腫瘤 中發(fā)現(xiàn)了部分血管數(shù)量的增加（圖4g)，但是在這些敲入ΗΒΧ基因的18個月小鼠的肺部卻 沒有出現(xiàn)迀移的囊腫。基于這些結(jié)果，我們認(rèn)為miR-122的抑制在人和小鼠中會引起不同 類型的肝臟功能的病理性變化，包括腫瘤大小，血管新生和腫瘤迀移。
[0019] 在本項(xiàng)研究中，我們證明了 miR-122靶向于TGF0 1通路中的不同組分，即人的 TGFi3 1和小鼠的TGFi3 R1，這第一次佐證了物種之間miRNA信號通路的不同。這種依賴于 不同物種間的miRNA調(diào)節(jié)配體/受體活力，從而作用于同一通路的現(xiàn)象，證明了一種新的功 能保守的機(jī)制。在正常條件下，miRNA導(dǎo)致的受體或者配體的抑制會對下游信號分子造成 相似的調(diào)控效應(yīng)。然而，這種類型的調(diào)控可能會因?yàn)閙iRNA的異常調(diào)控而在不同物種間產(chǎn) 生比較有趣的結(jié)果，比如在癌癥中、病理或壓力條件下。我們的結(jié)果清晰地表明miR-122的 缺失能夠在人和小鼠的肝癌迀移時展現(xiàn)出明顯不同的影響。
[0020] 除了癌癥，其他類型的肝臟疾病中也會出現(xiàn)miR-122失調(diào)的現(xiàn)象2°。例如miR-122 在非酒精性脂肪肝炎患者中降低了 40%，或丙肝病毒感染者miR-122會降低到正常的 50-60%。我們的發(fā)現(xiàn)為肝癌或者相關(guān)疾病提供了可能的新的治療和預(yù)防方案，并且與 Santaris制藥公司近期進(jìn)行的二期臨床直接相關(guān)21。目前使用抗microRNA-122藥物 miravirsen治療HCV而且無劑量限制等不良影響。研究結(jié)果表明在未來的臨床研究中需要 小心地控制TGFi3 1的濃度，因?yàn)門GFi3 1是一種廣泛存在并參與免疫排斥、心臟疾病、代謝 綜合征和其他病理特征的信號蛋白分子。
[0021] 材料和方法：
[0022] siRNA雙鏈，miRNA模擬體，細(xì)胞培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染和感染
[0023] siRNA雙鏈和所有的miRNA模擬體都是從上海吉瑪制藥公司購買。RNAi沉默效率 是在轉(zhuǎn)染后24-48h用實(shí)時定量PCR反應(yīng)檢測。每個反應(yīng)都是3個平行，所有基因的PCR引 物序列在表S2列出。
[0024] Hela，！fepG2, Huh7,293T，PANC-1，MCF-7, ！fepal-6 和 C5. 18 細(xì)胞都使用含有 10% 胎牛血清、lOOunits/ml青霉素和0. lmg/ml鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)，同時NiT-Ι細(xì)胞使用 低糖DMEM培養(yǎng)。人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC)由北京大學(xué)黃巖誼捐贈，使用含有1%ECGS、 5% FBS和1% P/S的ECM(ScienCell)培養(yǎng)基和附著鼠尾膠原蛋白的培養(yǎng)皿培養(yǎng)。豬腎內(nèi) 皮細(xì)胞（LLC-PK1)使用含3% FBS和1% P/S的M199培養(yǎng)基（Gibco)培養(yǎng)。所有細(xì)胞都 是在5% C0237°C的溫潤條件下培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)2-3天之后使用PBS清洗，然后用含0. 5mM EDTA0. 25%的胰酶消化，使用含有血清的培養(yǎng)基終止消化反應(yīng)。離心后使用培養(yǎng)基重懸，血 球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，然后以合適的細(xì)胞密度接種。
[0025] 使用Lipofectamine 2000 (Invitrogen)作為轉(zhuǎn)染試劑。細(xì)胞數(shù)量和核酸用量以 說明書操作。293T細(xì)胞使用慢病毒侵染，HepG2細(xì)胞使用之前提到的不同病毒感染。轉(zhuǎn)染 48h后，換液并加入噪呤霉素（Sigma)至終濃度為2ug/ml。篩選3-5周后，分別選擇穩(wěn)定的 細(xì)胞系作為ifepG2-NC、!fepG2-122和Η印G2-122-TGF細(xì)胞系。
[0026] 熒光素酶檢測實(shí)驗(yàn)
[0027] 克隆不同基因的5' UTR和3' UTR連接到螢火蟲熒光素酶基因的5'和3'區(qū)域構(gòu) 建相應(yīng)的PGL3載體，進(jìn)行熒光素酶報告實(shí)驗(yàn)。使用4. OX 104Hela細(xì)胞，共轉(zhuǎn)染200ng構(gòu)建 的基因載體和20ng海腎熒光素酶pGL3對照載體，同時，轉(zhuǎn)染相應(yīng)的miRNA質(zhì)粒載體或者 模擬體。48h后，裂解細(xì)胞并使用雙熒光素酶報告分析系統(tǒng)（Promega)檢測熒光素酶活力。
[0028] 人肝組織和miRNA檢測
[0029] 人原發(fā)性肝癌組織和癌旁組織組織均從北京大學(xué)第三醫(yī)院獲得。在進(jìn)行手術(shù)前， 所有病人都已簽署知情同意書允許將多余的組織用于科研研究。根據(jù)美國聯(lián)合委員會對腫 瘤淋巴轉(zhuǎn)移的第六版分類，這些患者被分為Ι、Π 、ΙΙΙ期。對所有手術(shù)切下的組織迅速冷凍 并儲存在干冰中。不同細(xì)胞系和組織的miRNA表達(dá)量使用之前建立的方法29。
[0030] 上清收集和酶聯(lián)免疫試驗(yàn)
[0031] 以合適的濃度接種不同的細(xì)胞，48h后細(xì)胞達(dá)到80%匯合度，將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)至無菌 管中。離心后，收集上清凍存在-80°C用于中和反應(yīng)，上清用含有l(wèi)ug/ml的中和抗體（R&D) 室溫預(yù)處理2小時。使用酶聯(lián)免疫反應(yīng)（ELISA)檢測上清液中的TGFi3 1和VEGF的濃度。 檢測TGF0 1的Emax免疫反應(yīng)試劑盒是從Promega公司購買，VEGF的ELISA試劑盒從R&D 公司購買。實(shí)驗(yàn)的操作均按照公司提供的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行。
[0032] 免疫熒光試驗(yàn)
[0033] 6孔板每孔接種lX105Huh7細(xì)胞，細(xì)胞貼壁后，使用不含胎牛血清的DMEM培養(yǎng) 基過夜培養(yǎng)，然后分別換成不同的上清培養(yǎng)液。其中一個孔加入終濃度為2. 5ng/ml的重 組TGFM(Sino Biological Inc.)作為陽性對照。24h后，依次使用4%福爾馬林固定細(xì) 胞，0. 1% Triton X-100通透，2% BSA室溫封閉lh。分別使用相應(yīng)的第一抗體對鈣黏蛋白 和波形蛋白反應(yīng)，并用抗兔第二抗體或者抗小鼠第二抗體、F(ab'）2片段（Alexa Fluor? 488Conjugate) (Cell Signalling Tech.)進(jìn)行可視化標(biāo)記反應(yīng)。所有焚光圖片均使用 Nikon TE2000_E(CCD:Regita 2000R，Qimaging，Canada)拍攝。
[0034] 免疫印跡
[0035] 從細(xì)胞或者組織中提取總蛋白后使用SDS-PAGE電泳分離，然后轉(zhuǎn)膜到聚偏氟乙烯 膜（Millipore Corporation)。這些膜分別使用 TGF β 1 (R&D)、TGF β 2 (R&D)、TGF β 3 (R&D)、 TGF 0Rl(R&D)、Smad2 (Cell Signaling Tech·)、Phospho_Smad2 (Cell Signaling Tech·)、 E-cadherin(Cell Signaling Tech.)、vimentin(Abeam)和 β-actin(Santa Cruz)作第一 抗體標(biāo)記。所有的圖像都使用Quantity One軟件?i〇-