子液以2v%_10v%的接種量接種到所述發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度30-40°C，轉(zhuǎn)速150-300rpm，通氣量0.1-1.0vvm，pH為6.0-8.0的條件下進行發(fā)酵產(chǎn)2，3-丁二醇。
[0018]本發(fā)明中2，3- 丁二醇發(fā)酵可以采用批式流加發(fā)酵，當殘?zhí)菨舛冉档?0_20g/L時開始補加微藻水解液，發(fā)酵48-96h結(jié)束。其中流加的微藻水解液為微藻多次培養(yǎng)的藻液，經(jīng)靜置沉淀后排出上清液，得到的藻泥利用蝸牛酶和稀酸組合水解后得到可發(fā)酵糖液。
[0019]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果:
1、通過對微藻培養(yǎng)過程中氮含量的分段控制，有助于微藻細胞的增殖和淀粉積累，可獲得高淀粉含量的藻細胞；在微含N元素培養(yǎng)階段，在培養(yǎng)基中加入適量3-磷酸甘油酸，可以避免藻細胞內(nèi)部積累的淀粉轉(zhuǎn)化為其他細胞成分，使其主要以淀粉形式存在，有助于獲得高濃度的水解糖。
[0020]2、微藻培養(yǎng)時，在起始階段通入低含量CO2，控制光暗比為10:14-14:10，培養(yǎng)到對數(shù)生長期停止；靜置沉降后排出上清液，然后提高CO2含量和PH值并提高光暗比為18:6-24: 0，培養(yǎng)至穩(wěn)定期。通過上述培養(yǎng)，有助于加速微藻對環(huán)境的適應性和快速增殖，有助于提高藻細胞的淀粉含量。
[0021]3、微藻處理時，通過蝸牛酶組合稀酸水解過程，可以顯著提高水解液中可發(fā)酵糖含量，從而有助于提高最終發(fā)酵產(chǎn)物濃度。
[0022]4、本發(fā)明所用原料不存在與人爭糧、與糧爭地等問題，能夠有效減低生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)2，3- 丁二醇的成本；直接采用藻泥帶渣發(fā)酵，省去微藻離心和干燥過程，節(jié)能能耗，同時還能充分利用微藻中的蛋白質(zhì)作為2，3-丁二醇發(fā)酵N源。本發(fā)明工藝為微藻下游產(chǎn)業(yè)開辟了一種新途徑。
【具體實施方式】
[0023]本發(fā)明利用含淀粉微藻為原料生產(chǎn)2，3- 丁二醇的方法，首先將微藻種子液接入富含N元素的微藻培養(yǎng)基中，培養(yǎng)到對數(shù)生長期停止，使微藻快速增殖；靜置沉降后排出上清液，添加含微量N元素的微藻培養(yǎng)基和適量3-磷酸甘油酸繼續(xù)培養(yǎng)，有助于微藻胞內(nèi)淀粉的穩(wěn)定積累，培養(yǎng)至穩(wěn)定期獲得含淀粉的藻液。在上述培養(yǎng)好的藻液中，加入蝸牛酶進行破壁處理，隨后按照最終水解體系中酸濃度為0.5wt%-5.0wt%加入無機酸，升溫至100-120°C進行水解，獲得微藻水解液。最后以得到的微藻水解液作為碳源制備發(fā)酵培養(yǎng)基，剩余部分作為后續(xù)發(fā)酵的流加液，采用克雷伯氏菌發(fā)酵生產(chǎn)2，3- 丁二醇。
[0024]本發(fā)明中微藻培養(yǎng)反應器為通氣攪拌式封閉反應器，帶有可控光照系統(tǒng)，可以通入二氧化碳氣體，并設置二氧化碳和溶解氧的測定裝置，根據(jù)需要調(diào)整通氣量，以獲得良好的培養(yǎng)效果。攪拌槳具有可收縮性，當微藻沉淀時收起攪拌槳，不影響沉降效果。微藻培養(yǎng)反應器能精確控制PH和攪拌轉(zhuǎn)數(shù)，保證微藻培養(yǎng)和2，3- 丁二醇發(fā)酵過程的穩(wěn)定。
[0025]本發(fā)明中pH控制酸中和劑為HCl、H2S04、HNO3等常用的無機酸，堿中和劑為NaOH、NaHCO3, Κ0Η、Ca (OH) 2、氨水等常用的無機堿。
[0026]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明方案作進一步說明。本發(fā)明中，wt%為質(zhì)量分數(shù)，v%為體積分數(shù)。
[0027]實施例1
微藻培養(yǎng)基的制備:采用BGll培養(yǎng)基(以每升計)=NaNO3 1.5g，K2HPO4.3H20 0.04g,MgSO4.7H20 0.075g, CaCl2.2H20 0.036g，檸檬酸 0.006g，檸檬酸鐵銨 0.006g, EDTA 0.001g, NaCO3 0.02g, A5+Co 溶液 I mL。其中 A5+Co 溶液的配方為=H3BO3 2.86g, MnCl2.H2O
1.81g, ZnSO4.7H20 0.222g, CuSO4.5H20 0.079 g, Na2MoO4.2H20 0.390 g, Co (NO3)2.6H200.049 go
[0028]微藻種子液的制備:將小球藻{Chlorella vulgaris)種子接入上述微藻培養(yǎng)基，在溫度30°C，通氣量0.25vvm, CO2含量為lv%，攪拌轉(zhuǎn)速lOOrpm，pH 7.0，光暗比10:14的條件下培養(yǎng)至對數(shù)生長期。
[0029]( I)微藻培養(yǎng):將微藻種子液按照接種量5v%接入富含N元素的微藻培養(yǎng)基中，富含N元素是指在培養(yǎng)基中按照2.5 g/L加入NaNO3,培養(yǎng)到對數(shù)生長期停止；靜置沉降后排出上清液，添加含微量N元素的培養(yǎng)基和3-磷酸甘油酸繼續(xù)培養(yǎng)，NaNO3的加入量為0.05g/L，3-磷酸甘油酸的加入量為0.02g/L。上述微藻培養(yǎng)是在溫度30°C，通氣量0.25vvm, CO2含量為lv%，攪拌轉(zhuǎn)速100 rpm,pH 7.0，光暗比14:10的條件下培養(yǎng)至穩(wěn)定期，收獲藻液，其中淀粉含量達50%。淀粉含量檢測方法，取兩份10 mL(V)藻液，離心去離子水洗2次，加入10 mL去離子水重懸。其中一份80°C烘干至恒重得到藻干重W。另一份600 W超聲破碎，超聲時間I S，間歇時間2 S，超聲60次，得到完全破碎的藻液。調(diào)節(jié)pH到6.5，分別加入0.20P I Liquozyme Supra 85_95°C保溫液化 I h ;調(diào)節(jié)pH到 4.5,分別加入0.4 P I DextrozymeDX 60°C保溫液化10h，水解完全后離心棄沉淀，上清液定容100 mL,檢測水解液中葡萄糖含量C。以去離子水加等量酶水解為對照。淀粉含量(g/g)=C(g/L) XV(L) X0.9/ff(g)。
[0030](2)藻液處理:在步驟(I)的藻液中，按照20mg蝸牛酶/g藻液加入蝸牛酶進行破壁處理，控制破壁處理的pH 6.0，溫度為40°C ;隨后按照最終水解體系中酸濃度為2.5wt%加入硫酸，升溫至115°C進行水解，保溫10-60min，獲得微藻水解液。水解處理后，水解液中的糖濃度約為84g/L。
[0031](3)發(fā)酵培養(yǎng):以微藻水解液為碳源制備發(fā)酵培養(yǎng)基，米用克雷伯氏菌發(fā)酵生產(chǎn)2，3-丁二醇。
[0032]以步驟(2)制備的微藻水解液為碳源制備發(fā)酵培養(yǎng)基，并加入以下物質(zhì):氮源(NH4)2HPO4 3.3g/L，(NH4)2SO4 6.6g/L ;無機鹽 K2HPO4.3H20 13.7g/L，KH2PO4 2.0g/L ;微量元素 MgSO4.7H20 0.25g/L, FeSO4.7H20 0.05g/L, ZnSO4.7H20 0.002 g/L, MnSO4.H2O0.0Olg/L, CaCl2 0.01 g/L, EDTA0.05 g/L，pH 控制在 7.0，初始糖濃度約 84 g/L。
[0033]以克雷伯氏菌為發(fā)酵菌種制備2，3-丁二醇，發(fā)酵菌種子液的制備方法如下:取活化的克雷伯氏桿菌，是由中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心提供的，編號為克雷伯氏菌CICC10011。接種到含葡萄糖20g/L，酵母浸膏3g/L，蛋白胨8 g/L，氯化鈉5g/L的培養(yǎng)基中，在溫度37°C，轉(zhuǎn)速200rpm，pH為7.0條件下培養(yǎng)12h，細胞干重3.0 g/L左右。
[0034]將上述克雷伯氏菌種子液以5v%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度35V’轉(zhuǎn)速150 rpm，通氣量0.25vvm,pH 7.0的條件下進行發(fā)酵產(chǎn)2，3- 丁二醇。發(fā)酵16 h后殘?zhí)菨舛鹊陀?0 g/L，流加微藻水解液使發(fā)酵體系糖濃度為200g/L，發(fā)酵共進行48 h，發(fā)酵液中2，3- 丁二醇和乙偶姻最終濃度之和為73.llg/L。
[0035]實施例2
處理工藝和操作條件同實施例1，不同之處在于:(1)微藻采用萊茵衣藻{Chlamydomonas reinhardtii),微藻培養(yǎng)基米用TAP培養(yǎng)基；(2)N源為NH4Cl,富N培養(yǎng)時加入量為3g/L，含微量N培養(yǎng)時加入量為0.02g/L ; (3) 3-磷酸甘油酸的加入量為0.0lg/L ； (4)按照20mg蝸牛酶/g藻液加入蝸牛酶進行破壁處理，控制破壁處理的pH 8.0，溫度為30。。。
[0036]TAP 培養(yǎng)基配方為(以每升計):H2NC (CH2OH)3 2.42 g，TAP 鹽 25 mL (NH4Cl 15 g/L，MgSO4.7Η20 4 g/L, CaCl.2H20 2 g/L)，磷酸溶液 I mL (K2HPO4 28.8 g /100 mL, KH2PO414.4 g/100 mL)，微量元素 I mL (Na2EDTA.2H20 5.00 g/100 mL, ZnSO4.7H20 2.20 g/100mL, H3BO3 1.14 g/100 mL, MnCl2.4H20 0.50 g/100 mL，F(xiàn)eSO4.7H20 0.50 g/100 mL, CoCl2? 6H20 0.16 g/100 mL, CuSO4.