，并設立不含有TLCK的棉鈴蟲中腸消化酶液為空白對照。同時以商品化的類胰蛋白酶為對照組，即配制濃度為lmg/mL的類胰蛋白酶溶液，將抑制劑溶液和類胰蛋白酶溶液分別按10:1和1:1的體積比混合，相應地，設立不含有TLCK的lmg/mL的類胰蛋白酶溶液為空白對照。
[0023]3、用ρΗΙΟ.0的Na⑶3緩沖液將Cry IAc配制成lmg/mL的溶液，實驗組是將準備好的抑制劑和中腸消化酶液的混合液與CrylAc原毒素溶液按1:100的體積比混合，37°C分別孵育30分鐘和2小時;然后用5 X蛋白上樣緩沖液終止反應，在沸水中煮6min?？瞻讓φ兆鱿嗤幚?。
[0024]對照組是將準備好的抑制劑和類胰蛋白酶溶液的混合液與CryIAc原毒素溶液按I: 100的體積比混合，37°C分別孵育30分鐘和2小時;然后用5 X蛋白上樣緩沖液終止反應，在沸水中煮6min?？瞻讓φ兆鱿嗤幚?。
[0025]4、將步驟3中準備好的實驗組及對照組樣品分別加至8%的聚丙烯酰胺凝膠上進行SDS-PAGE電泳分離。電泳結(jié)束后，用考馬斯亮藍進行染色。
[0026]5、染色后，對膠圖進行拍照，根據(jù)對應條帶的大小深淺，利用Image J software(ΝΙΗ,νΙ.46)對CrylAc的活化效果進行定量，用消化后的CrylAc原毒素的量(實驗組)除以同一塊膠上對照組CrylAc原毒素的量，即為活化效率。
[0027]6、最后通過方差分析(SPSS vers1n 18.0software for Windows)來評價中腸消化酶(特別是類胰蛋白酶)參與的Cry I Ac活化作用。
[0028]對照組中類胰蛋白酶活化CrylAc原毒素及對應的活化效率見圖1，圖1結(jié)果顯示，30分鐘和2小時后CrylAc原毒素都能被商品化的類胰蛋白酶完全消化(泳道3和泳道6)。10:1的類胰蛋白酶和TLCK混合液在30分鐘(P〈0.0001)和2小時(P〈0.0001)時都顯著地抑制了類胰蛋白酶對CrylAc原毒素的消化。其活化的效率分別是12.06%和13.04% (泳道4和泳道7)。1:1的類胰蛋白酶和TLCK混合液在30分鐘(P〈0.0001)和2小時(P〈0.0001)時都顯著的抑制了類胰蛋白酶對CrylAc原毒素的活化。其活化的效率分別是7.92%和11.40% (泳道5和泳道8) ^LCK能夠有效的抑制類胰蛋白酶對CrylAc原毒素的活化，并有效的說明了該酶參與CrylAc原毒素活化的過程。
[0029]實驗組棉鈴蟲中腸消化酶液活化CrylAc原毒素及對應的活化效率見圖2。圖2結(jié)果顯示，在30分鐘時CrylAc原毒素被棉鈴蟲中腸消化酶液消化了87.34%，2小時CrylAc原毒素能被中腸消化酶液完全消化(泳道3和泳道6)。3 O分鐘時，1:1 (P = 0.0 3 7)和1:1 (P =
0.02)的中腸消化酶和TLCK混合液能顯著的抑制中腸消化酶對CrylAc原毒素的活化。其活化的效率分別是67.87%和57.36% (泳道4和泳道5)。在2小時時，10:1和1:1的中腸消化酶和TLCK混合液對CryIAc原毒素活化的效率分別是92.66 %和86.67 %。結(jié)果表明TLCK能夠有效的抑制棉鈴蟲中腸消化酶液對CrylAc原毒素的活化，說明了該中腸消化酶液中的類胰蛋白酶參與CrylAc原毒素活化的過程。但2小時以后，10:1和1:1的中腸消化酶和TLCK混合液對CrylAc原毒素的活化能力與中腸消化酶液沒有顯著差異(P = 0.082和P = 0.097)，該結(jié)果表明在中腸消化酶液中除了類胰蛋白酶參與活化過程外，同時還有其他消化酶參與了Cry I Ac活化作用。
[0030]雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。
【主權(quán)項】
1.一種評價昆蟲中腸消化酶對Bt蛋白活化作用的方法，其特征在于，將特異性消化酶抑制劑與昆蟲中腸消化酶液按比例混合，在體外對Bt蛋白原毒素進行活化，然后通過聚丙烯酰胺凝膠電泳對活化效果進行分析，用軟件ImageJ 1.46對結(jié)果進行統(tǒng)計，最后通過方差分析來評價中腸消化酶參與的Bt蛋白活化作用。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述昆蟲包括鱗翅目、雙翅目、鞘翅目、膜翅目、同翅目、直翅目、食毛目昆蟲，以及線蟲、螨類。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述昆蟲為棉鈴蟲。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述特異性消化酶抑制劑對應于昆蟲中腸消化酶中一種特定的蛋白酶。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述特異性消化酶抑制劑包括TLCK。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，包括以下步驟: 1)配制一定濃度的昆蟲中腸消化酶液； 2)將一定濃度的特異性消化酶抑制劑溶液與步驟I)的昆蟲中腸消化酶液按不同比例混合，再與一定濃度的Bt蛋白原毒素溶液混合孵育一段時間，用蛋白上樣緩沖液終止反應，在沸水中煮5-10min后，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，考馬斯亮藍染色； 3)根據(jù)染色結(jié)果，用軟件ImageJ1.46對Bt蛋白原毒素的活化效果進行定量分析，最后用軟件SPSS 18.0進行方差分析來評價中腸消化酶參與的Bt蛋白活化作用。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟I)中配制的昆蟲中腸消化酶液，用Bradf ord法定量到蛋白濃度lmg/ mL。8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟2)中將lmg/mL的特異性消化酶抑制劑溶液與步驟I)的昆蟲中腸消化酶液分別按10:1和1:1的體積比混合，所得混合液與lmg/mL的Bt蛋白原毒素溶液按1:100的體積比混合，37°C孵育5min-2h;然后用5X蛋白上樣緩沖液終止反應，在沸水中煮6min。9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟2)中用8%的聚丙烯酰胺凝膠電泳。10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟2)中同時設立不含有所述特異性消化酶抑制劑的昆蟲中腸消化酶液為空白對照，即將不含有所述特異性消化酶抑制劑的昆蟲中腸消化酶液與Bt蛋白原毒素混合孵育。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種評價昆蟲中腸消化酶對Bt蛋白活化作用的方法，其是將特異性消化酶抑制劑與昆蟲中腸消化酶液按比例混合，在體外對Bt蛋白原毒素進行活化，然后通過聚丙烯酰胺凝膠電泳對活化效果進行分析，用軟件ImageJ？1.46對結(jié)果進行統(tǒng)計，最后通過方差分析來評價中腸消化酶參與的Bt蛋白活化作用。本方法可操作性強，準確高效，可用于評價哪些不同的消化酶參與了不同類Bt蛋白的活化，同時還可以分析不同消化酶在活化Bt蛋白中的主次作用，對于選擇合理的Bt組合殺蟲劑或轉(zhuǎn)疊加基因作物具有借鑒作用。此外，該方法可應用于對Bt生化水平抗性的評價工作。
【IPC分類】C12Q1/37
【公開號】CN105624267
【申請?zhí)枴緾N201610089908
【發(fā)明人】魏紀珍, 梁革梅, 王冰潔, 陳琳, 張萬娜
【申請人】中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所
【公開日】2016年6月1日
【申請日】2016年2月17日