一種用于Small RNA二代測序建庫的接頭處理方法
【技術領域】
[0001]本申請涉及DNA測序文庫的構建領域，特別是涉及一種應用于Small RNA 二代測序建庫的接頭處理方法及其應用。
【背景技術】
[0002]世界衛(wèi)生組織最新發(fā)布的《全球癌癥報告2014》指出，2012年全球癌癥患者和死亡病例都在增加，中國新增病例和死亡人數(shù)均居世界首位。我國腫瘤登記中心發(fā)布的《2012中國腫瘤登記年報》顯示，全國每年新發(fā)腫瘤病例估計約為312萬例，平均每天8550人，全國每分鐘有6人被診斷為惡性腫瘤。全國35歲至39歲年齡段中，平均每10萬人中有87.07人會罹患癌癥，而在40歲至44歲年齡段中，這一數(shù)字達到了 154.53。目前，我國居民因癌癥死亡的幾率達13 %，癌癥已經(jīng)成為嚴重危害人類健康、導致現(xiàn)代人類死亡的第一大惡疾和頑癥。
[0003]20世紀以來，隨著現(xiàn)代醫(yī)學技術在癌癥的診斷和治療方面的進步，癌癥死亡率雖然有所下降，但是收效甚微。臨床研究表明，肺癌患者如果在早期發(fā)現(xiàn)，5年存活率是90%，而晚期患者90%都會死亡?？梢姲l(fā)展癌癥的早期診斷技術能極大降低癌癥的死亡率。在癌癥的治愈率上，目前發(fā)達國家已達65%，我國僅有25%左右。在科學家探索癌癥治療的各種策略中，腫瘤特異性靶向?qū)氚┘毎呗?，特異性強，效果顯著，基本上不損傷正常組織，因此腫瘤靶向治療是腫瘤治療中最有前景的方案。
[0004]Small RNA是一大類調(diào)控分子,包括miRNA、ncRNA、siRNA、piRNA等,其幾乎存在于所有的生物體中。Small RNA是生命活動的重要的調(diào)控因子，在基因表達、生物個體發(fā)育、代謝及疾病的發(fā)生等生理過程起著重要的作用。Small RNA的異常表達與特定的癌癥、疾病的發(fā)生和發(fā)展相關，因而small RNA可作為癌癥早期診斷和預后的生物標記分子，如exosome中的miR-451與卵巢癌的化療耐藥性相關以及參與神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的增殖和遷移過程，miR-451也能作為腎細胞癌的潛在標記物。此外還可以通過調(diào)控特定small RNA的表達來進行癌癥的靶向治療。正是由于small RNA在癌生物學上具有巨大的應用潛能，因此進行small RNA的研究具有巨大的現(xiàn)實意義，可以通過構建small RNA文庫，進行測序分析，了解small RNA的表達情況以進行癌癥的診斷以及發(fā)展后續(xù)的靶向治療。
[0005]目前的各種測序平臺中，常規(guī)的建庫技術主要包括SingleEnd即SE建庫技術，和Pair End Index即PEI建庫技術。其中，PEI建庫技術的接頭是雙鏈的Y型接頭，因此不能直接將PEI的接頭加到small RNA上構建成PEI文庫；所以，對于small RNA而言，其文庫構建技術主要是SE建庫技術。在進行測序時，PEI文庫和SE文庫的測序試劑是不同的，small RNA的SE文庫需要采用特殊的測序試劑才能進行測序,這極大的限制了 small RNA的測序分析研究，及其在癌癥診斷和后續(xù)靶向治療中的應用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本申請的目的是提供一種新的應用于Small RNA二代測序的建庫接頭方法及其應用。
[0007]為了實現(xiàn)上述目的，本申請采用了以下技術方案:
[0008]本申請一方面公開了一種應用于Small RNA 二代測序建庫的接頭處理方法，包括以下步驟，
[0009]A.分別在樣品Small RNA片段的兩端添加SE文庫的3’接頭和5’接頭；
[0010]B.將連接好3’接頭和5’接頭的Small RNA片段反轉錄成cDNA ；
[0011]C.在反轉錄的cDNA片段的3’末端加“A” ；
[0012]D.在步驟C的cDNA片段上連接PEI文庫的“Y”型接頭，即獲得可用于PEI文庫構建的接頭Small RNA片段。
[0013]需要說明的是，本申請的接頭處理方法是在原本的SE文庫構建技術的基礎上改進得到的，步驟A、B可以參考常規(guī)的SE文庫構建方法進行，其中SE文庫的3’接頭和5’接頭、反轉錄成cDNA、回收純化等都可以參考常規(guī)的方式進行；步驟C、D中的3’末端加“A”，以及連接PEI文庫的“Y”型接頭也都可以參考常規(guī)的PEI文庫構建方法進行，在此不累述。還需要說明的是，實際上，按照常理來說，PEI文庫的接頭是雙鏈的Y型接頭，不能直接加到small RNA上構建成PEI文庫，并且在測序時small RNA的兩端也是不能隨便添加接頭的；本申請在SE文庫的基礎上，進一步的添加PEI文庫接頭，從而簡單有效的解決了 SE文庫和PEI文庫在測序時的測序試劑不相容問題，為small RNA測序的進一步推廣應該奠定了基礎。
[0014]優(yōu)選的，在步驟C之前，還包括對反轉錄成的cDNA進行回收純化，然后將回收純化的cDNA進行步驟C的3’末端加“A”處理。
[0015]優(yōu)選的，本申請的接頭處理方法還包括步驟E，將步驟D的連接好“Y”型接頭的cDNA片段純化回收。需要說明的是，通常來說，在接頭添加完成后，都需要進行純化回收，以便后續(xù)處理；其中步驟E的cDNA片段純化回收可以參考常規(guī)的cDNA片段純化回收方法，在此不累述。
[0016]本申請的另一面公開了本申請的接頭處理方法在Small RNA的二代測序中的應用。
[0017]本申請的另一面公開了本申請的接頭處理方法在RNA樣品的二代測序中的應用。
[0018]在本申請的接頭處理方法的基礎上，本申請還公開了一種用于Small RNA 二代測序的建庫方法，包括采用本申請的接頭處理方法對Small RNA樣品進行接頭處理，然后對接頭處理好的樣品進行文庫PCR擴增，回收純化PCR擴增產(chǎn)物即獲得文庫樣本。
[0019]需要說明的是，其中PCR擴增和回收純化PCR擴增產(chǎn)物都可以參考常規(guī)的文庫PCR擴增和回收方法進行，在此不累述。
[0020]本申請還公開了本申請的建庫方法在Small RNA的二代測序中的應用。
[0021]本申請還公開了本申請的建庫方法在RNA樣品的二代測序中的應用。
[0022]由于采用以上技術方案，本申請的有益效果在于:
[0023]本申請的用于Small RNA 二代測序建庫的接頭處理方法，創(chuàng)造性的在SE接頭的基礎上添加PEI接頭，使得構建的Small RNA文庫在測序時能夠適用于PEI文庫的測序試劑，從而解決了 SE文庫和PEI文庫測序試劑不相容的問題，方便了 Small RNA的測序分析研究，為基于Small RNA測序的癌癥診斷和后續(xù)靶向治療提供了便利。
【附圖說明】
[0024]圖1:是本申請實施例中接頭處理技術的技術原理及路線圖；
[0025]圖2:是本申請實施例中建庫流程圖。
【具體實施方式】
[0026]Small RNA測序通常都是構建SE文庫進行，并且基于SE文庫的Small RNA測序也能夠很好的滿足研究需求；唯一的不足則是，SE文庫的Small RNA測序需要特殊的iIIumina測序試劑，并且，不能采用常規(guī)的基于PEI文庫的DNA測序試劑替換，這對基于Small RNA測序的研究和應用造成了限制。因此，本申請創(chuàng)造性的在Small RNA的SE文庫的基礎上，進一步添加PEI文庫接頭，構建Small RNA的PEI文庫，使得Small RNA測序可以采用常規(guī)的基于PEI文庫的DNA測序試劑。
[0027]需要說明的是，Small RNA是單鏈，可以很方便的加SE文庫的單鏈3’端和5’接頭，構建成SE文庫，但是PEI的接頭是雙鏈的Y型接頭，因此不能直接將PEI的接頭加到small RNA上構建成PEI文庫。將small RNA加上接頭反轉錄成雙鏈DNA后再加PEI的Y型接頭構建PEI文庫時，還必須考慮后續(xù)測序引物的使用，因此不能在small RNA上任意加其它接頭；本申請經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)構建SE文庫的RNA PCR Primer(RPl)和構建PEI文庫的Multiplexing PCR Primer 1.0 序列有 29bp 是相同的,SE 文庫的 RNA PCR Primer, IndexI和PEI文庫的PCR Primer, Index I的序列有44bp是相同的，因此使得本申請的接頭處理技術具備可行性。在此研究發(fā)現(xiàn)的基礎上，本申請創(chuàng)造性的率先提出了本申請的接頭處理技術，從而使得構建的Small RNA文庫可以使用PEI的測序試劑進行測序，為基于SmallRNA測序的研究奠定了基礎。
[0028]還需要說明的是，本申請的接頭處理方法和文庫構建方法，雖然是針對Small RNA進行的，可以理解，其同樣可以適用于其它RNA樣品的接頭處理和文庫構建；而對于序列較長的RNA樣品，也可以在添加SE的接頭之前，根據(jù)需要進行片段化處理等步驟，在此不累述。
[0029]下面通過具體實施例和附圖對本申請作進一步詳細說明。以下實施例僅對本申請進行進一步說明，不應理解為對本申請的限制。
[0030]實施例
[0031]本例采用來源于血液中exosome的small RNA來構建small RNA文庫,本例的文庫構建包括接頭處理、文庫PCR以及PCR擴增產(chǎn)物的回收等步驟。
[0032]其中，接頭處理的方法具體如下:
[0033]1.small RNA片段連接SE文庫的3’接頭
[0034](I)反應液 I
[0035]將3’接頭(RNA 3’ Adapter,簡寫RA3) I μ L加入到5 μ L的不含核酸酶的smallRNA水溶液中，混勻，在Thermal cycler中70°C反應2min后立即放置于冰上，即反應液I。
[0036](2) Mix 的配置
[0037]Mix 溶液包括:2 μ L 連接 Buffer、I μ L RNase Inhibitor、I μ L T4 RNA Ligase2 (Delet1n Mutant),混勻制成 Mix 溶液。
[0038]將Mix溶液全部加入到置于冰上的反應液I中，Thermal cycler中28°C反應I小時后，在28°C下向反應物中加入I μ L Stop Solut1n，然后28°C繼續(xù)孵育15min，最后將產(chǎn)物放置于冰上；即RA3產(chǎn)物。
[0039]2.small RNA片段連接SE文庫的5’接頭
[0040](I)在 RNase free 的 PCR 管中加入 l.lyL RNA 5’Adapter (5，接頭，簡寫 RA5)，在Thermal cycler中70°C反應2min后立即放置于冰上,備用；
[0041](2)在(I)中加入1.1yL 1mM的ATP，輕輕吹吸混勻后加入1.1yL T4 RNALigase，然后再吹吸混勻，混勻產(chǎn)物即為RA5 mix ；
[0042](3)取3 μ L RA5 mix加到放置于冰上的RA3