一種檢測致病性犬鉤端螺旋體的pcr引物及試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及檢測引物與試劑盒，具體地說，涉及檢測致病性犬鉤端螺旋體的PCR引 物及試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 鉤端螺旋體病(Leptospirosis)是一種在全世界范圍傳播的人畜共患疾病，簡稱 鉤體病，該病尤其廣泛存在于發(fā)展中國家和熱帶地區(qū)。犬對該病易感，感染后臨床表現(xiàn)多 樣，不易進行診斷。鉤體病的病原體會持續(xù)存在于宿主機體內(nèi)，會進一步擴散污染環(huán)境，感 染其他人和動物，危害嚴(yán)重。因而，犬患該病后，在危害其本身的健康的同時，還會威脅到其 主人的安全。因此，需要在早期對該病作出診斷，盡早控制該病。目前，診斷犬鉤體病的方法 有直接鏡檢、分離培養(yǎng)、血清學(xué)檢測、動物接種等實驗室檢測方法，與這些方法相比，PCR方 法更省時省力，特異性和敏感性優(yōu)異，并且可用于鉤體病的早期診斷。
[0003][0004]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的是提供一種省時省力，特異性和 敏感性優(yōu)異，檢測犬鉤端螺旋體LigB基因的PCR引物及試劑盒，可用于犬鉤端螺旋體病的早 期診斷。
[0006] 本發(fā)明原理在于選擇了犬鉤端螺旋體LigB基因作為檢測對象，并針對犬鉤端螺旋 體LigB基因特殊設(shè)計了引物，使引物具有優(yōu)異的特異性和敏感性。
[0007] 為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0008] 本發(fā)明提供一種檢測致病性犬鉤端螺旋體的PCR引物，所述引物如下：
[0009] 上游引物：5' -CTTGGGATTCTTCTAATMCSGATA-3' ；
[0010] 下游引物：5 ' -GATCCTTGTATTCCACCGATG-3 '。
[0011]所述引物的擴增片段長度為124bp。
[0012] 本發(fā)明還提供了所述引物在制備檢測致病性犬鉤端螺旋體的試劑盒方面的應(yīng)用。
[0013] 由于所述引物的擴增片段能夠證明犬鉤端螺旋體LigB基因的存在，從而證明致病 性犬鉤端螺旋體的存在，因此，所述引物可用來制備檢測致病性犬鉤端螺旋體的試劑盒。
[0014] 基于上述原因，本發(fā)明還提供了含有所述引物的試劑或試劑盒。
[0015] 具體為一種檢測致病性犬鉤端螺旋體的試劑盒，所述試劑盒包括前述引物、陽性 對照、陰性對照、Taq 酶、dNTP、10 X Buf f er、ddH20 〇
[0016] 進一步地，所述陽性對照的構(gòu)建方法為：
[0017] 1)以波摩那56608的基因組DNA作為模板，利用權(quán)利要求1所述的引物進行PCR擴 增，對PCR產(chǎn)物進行純化回收，與pMD18-T進行連接；
[0018] 2)向Transl-Tl克隆感受態(tài)中加入步驟1)獲得的連接產(chǎn)物，篩選陽性克隆，提取質(zhì) 粒。
[0019] 波摩那56608購自中國藥品生物制品檢定所鉤端螺旋體實驗室，保藏編號為 56608〇
[0020]為了更好的實現(xiàn)對致病性犬鉤端螺旋體的檢測，本發(fā)明優(yōu)化了所述試劑盒的工作 程序(尤其是退火溫度），使所述引物能夠最大程度地增加反應(yīng)成功率和反應(yīng)效果。
[0021] 優(yōu)化得到的工作程序為：94°C預(yù)變性3min; 94°C變性30 s，58°C退火30 s，72°C延伸 30s，29 個循環(huán)；72°C 延伸 5min。
[0022] 本發(fā)明的有益效果在于：
[0023] 本發(fā)明選擇LigB基因作為檢測對象，實現(xiàn)檢測致病性鉤端螺旋體的目的。本發(fā)明 提供了省時省力，特異性和敏感性優(yōu)異，檢測犬鉤端螺旋體LigB基因的PCR引物及試劑盒。 本發(fā)明提供的引物和試劑盒，可用于犬鉤端螺旋體病的早期診斷在該實驗中，建立并組裝 的犬鉤體病PCR方法特異性強，并且檢測鉤體濃度的靈敏度可達(dá)到lOkopies/yL。
【附圖說明】
[0024]圖1是本發(fā)明實施例2中摸索退火溫度的電泳檢測結(jié)果圖：其中，M:2000bp Marker，泳道1 ~5:退火溫度依次為56 °C，57 °C，58 °C，59 °C，60 °C。
[0025]圖2是本發(fā)明實施例3中靈敏度試驗的電泳檢測結(jié)果圖：其中，M:2000bp Marker， 泳道1~6分別為；1 X 10-6ng/yL-lng/yL，10倍梯度。
[0026]圖3是本發(fā)明實施例4中重復(fù)性試驗的電泳檢測結(jié)果圖：其中，M:2000bp Marker， 泳道1~3為同濃度同批次的模板DNA。
[0027]圖4本發(fā)明實施例5中特異性試驗的電泳檢測結(jié)果圖：其中，M: 2000bp Marker，泳 道1~8模板濃度依次為黃疸出血56601，犬56603,波摩那56608,非致病性鉤體566505,流感 傷寒56609，七日熱56610，塔拉索夫56635和空白對照。
[0028] 圖5本發(fā)明實施例8中標(biāo)準(zhǔn)陽性質(zhì)粒的靈敏度電泳結(jié)果圖：泳道1-9分別為10°-108copies/iiL〇
[0029] 圖6本發(fā)明實施例8中菌液的PCR檢測靈敏度電泳結(jié)果圖：泳道1-7分別為ΙΟΜΟ7鉤 體/ml。
【具體實施方式】
[0030] 下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的優(yōu)選實施方式進行詳細(xì)說明。需要理解的是以下實 施例的給出僅是為了起到說明的目的，并不是用于對本發(fā)明的范圍進行限制。本領(lǐng)域的技 術(shù)人員在不背離本發(fā)明的宗旨和精神的情況下，可以對本發(fā)明進行各種修改和替換。
[0031 ]下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0032]下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0033] 1、菌株和臨床樣本
[0034] 鉤端螺旋體標(biāo)準(zhǔn)菌株黃疸出血56601，犬56603，波摩那56608，流感傷寒56609，七 日熱56610,塔拉索夫56635,非致病性鉤體566505,由課題所在實驗室傳代培養(yǎng)保存。
[0035] 2、主要儀器和試劑
[0036] 凝膠電泳圖像分析系統(tǒng)（北京六一儀器廠，中國）；梯度PCR儀(Biometra UNO，德 國）；C02恒溫培養(yǎng)箱(SANYO,日本），細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒以及膠回收試劑盒購自天根 公司，質(zhì)粒小量提取試劑盒購自O(shè)MEGA公司，；Taq酶、pMD_18t載體、Transl-Tl克隆感受態(tài)購 自大連寶生物有限公司；胰蛋白胨購自英國Oxoid公司，氨芐青霉素購自NEB公司，氯化鈉、 瓊脂糖等常規(guī)試劑購自國產(chǎn)公司。
[0037] 實施例1引物設(shè)計與合成
[0038] 根據(jù)GenBank中已發(fā)表的LigB基因序列，應(yīng)用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計得到 引物，經(jīng)篩選得到本發(fā)明所述的引物。
[0039] 篩選得到的引物通過NCBI中的BLAST進行特異性鑒定，如表1所示。引物均由大連 寶生物公司合成。
[0040] 表1通用引物序列
[0041]
[0042]實施例2 PCR反應(yīng)程序的優(yōu)化
[0043]根據(jù)細(xì)菌組DNA提取試劑盒產(chǎn)品說明，從生長良好的鉤體菌液提取DNA作為模板。 [0044]以鉤體DNA為模板，首先對PCR反應(yīng)的退火溫度進行摸索，反應(yīng)體系和條件：10yL， Taq酶0 · lyL，實施例 1 所述上下游引物各0 · 5yL，dNTPO · 8yL，模版lyL，10 X Buf f er lyL， ddH20補足。
[0045] 反應(yīng)條件：941€3111丨11;941€3〇8，退火溫度3〇8,72 1€3〇8,29個循環(huán)；721€5111丨11。在梯 度PCR儀上進行，退火溫度設(shè)置溫度梯度，分別為:56.0 °C，57.0 °C，58.0 °C，59.0 °C，60.0 °C。 進行PCR反應(yīng)，并對PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果，如圖1所示。由圖1可知，當(dāng)退火 溫度為58.0 °C時，條帶最亮，檢測效果最好。
[0046] 實施例3靈敏度試驗
[0047]將實施例2提取的DNA模板經(jīng)過定量作為標(biāo)準(zhǔn)品，稀釋成Ing/yL，而后進行10倍梯 度稀釋，分別稀釋