然而，非糖基化形式的Fc γ RIIB也被 設(shè)想到，并且是Fc γ RIIB的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案。
[0065] 至于本發(fā)明所述抗體的重鏈可變區(qū)，優(yōu)選地，本發(fā)明所述抗體的重鏈可變區(qū)包含 SEQ ID N0.3中所示的氨基酸序列，并具有選自下述的突變中的至少一個(gè):位置1處的氨基 酸Q被E替代，位置11處的氨基酸V被L替代，位置42處的氨基酸G被K替代，位置50處的氨基酸 S被V替代，位置53處的氨基酸Y被S替代，位置58處的氨基酸K被T替代，位置61處的氨基酸G 被A替代，位置75處的氨基酸S被T替代，位置76處的氨基酸K被R替代，位置77處的氨基酸N被 S替代，和位置78處的氨基酸T被N替代。這樣的抗體優(yōu)選具有以下特征:包含重鏈恒定區(qū)即 SEQID N0.6中所示的氨基酸序列和/或輕鏈恒定區(qū)即SEQID N0.7中所示的氨基酸序列。 [0066]本發(fā)明所述的抗體優(yōu)選地具有以下特征:包含重鏈恒定區(qū)即SEQID N0.6中所示的 氨基酸序列和/或輕鏈恒定區(qū)即SEQID N0.7中所示的氨基酸序列。
[0067]在本發(fā)明所述的優(yōu)選抗體中，所述重鏈的恒定區(qū)在位置297(根據(jù)Edelman等1969 年所述的EU蛋白質(zhì)編號(hào)，對(duì)應(yīng)于圖2所示的SEQ ID NO.6代表的序列的編號(hào)）處包含丙氨酸 殘基(N297A)。本文為具有在位置297處包含丙氨酸(Ala，A)殘基(N297A)的重鏈的抗體指定 了后綴"_N297A"，而在所述位置處具有天冬氨酸(Asn，N)殘基的抗體是"野生型"的，因而為 其指定了后綴"(wt)"。如圖2中可見(jiàn)，人源化抗體8A6野生型的所述重鏈可變區(qū)以位置113 (根據(jù)EU蛋白質(zhì)編號(hào))處的氨基酸殘基"S"結(jié)尾。所述抗體的恒定區(qū)以位置118開始。產(chǎn)生的4 個(gè)氨基酸殘基的顯著間隙是由對(duì)于恒定區(qū)轉(zhuǎn)換成EU蛋白質(zhì)編號(hào)系統(tǒng)引起的，而不意味著任 何氣基酸殘基的丟失。
[0068]根據(jù)本發(fā)明在SEQ ID N0.6代表的所述氨基酸序列的位置297處具有丙氨酸殘基 的所述抗體由于抗體的Fc部分與Fc受體的結(jié)合減少或不存在而確實(shí)具有減少的或者沒(méi)有 抗體依賴性細(xì)胞毒性。SEQ ID N0.28中顯示了這類N297A恒定區(qū)的氨基酸序列。因此，本發(fā) 明所述的抗體可以包含SEQ ID N0.28中所示的氨基酸序列作為恒定區(qū)。這樣的抗體在位置 297(根據(jù)EU蛋白質(zhì)編號(hào))處缺少糖基化。因此，本發(fā)明不僅涵蓋在位置297(根據(jù)重鏈恒定區(qū) 的EU蛋白質(zhì)編號(hào)）處缺少糖基化的抗體，還涵蓋在位置297(根據(jù)重鏈恒定區(qū)的EU蛋白質(zhì)編 號(hào))處發(fā)生糖基化的抗體。
[0069] 在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明所述的抗體的恒定結(jié)構(gòu)域(Fc結(jié)構(gòu)域)具 有在位置214處包含氨基酸K(Lys)、在356位置處包含氨基酸E(Glu)、在位置358處包含氨基 酸M(Met)以及在位置431處包含氨基酸A(Ala)并且缺少C-端K(Lys)的同種異型Glml7(Beck 等，2010)。
[0070] 本文所用術(shù)語(yǔ)"同種異型"是指根據(jù)本發(fā)明所述抗體的人同種異型。同種異型是特 定同種型的恒定區(qū)序列內(nèi)的等位基因/遺傳變體。所述同種異型以等位基因的方式進(jìn)行遺 傳。因此物種的不同成員就他們從其親本繼承的給定同種型的特定等位基因而彼此不同。 Kml和Km2是人κ鏈的同種異型;Glm(4)和Glm(17)是人γ?鏈的同種異型。
[0071] 至于本發(fā)明所述抗體的輕鏈可變區(qū)，優(yōu)選地，本發(fā)明所述抗體的輕鏈可變區(qū)包含 SEQ ID Ν0.4中所示的氨基酸序列，并具有選自下述的突變中的至少一個(gè):位置1處的氨基 酸Q被N替代，位置28處的氨基酸S被N替代，位置31處的氨基酸S被T替代，位置33處的氨基酸 V被L替代，位置34處的氨基酸D被A替代，位置49處的氨基酸Y被F替代，位置53處的氨基酸T 被N替代，位置55處的氨基酸Y被A替代，位置89處的氨基酸L被Q替代，和位置93處的氨基酸N 被Y替代。這樣的抗體優(yōu)選具有以下特征:包含重鏈恒定區(qū)即SEQID N0.6中所示的氨基酸序 列和/或輕鏈恒定區(qū)即SEQID N0.7中所示的氨基酸序列。
[0072] 在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述恒定輕結(jié)構(gòu)域是在位置153處包含氨基酸A (Ala)并在位置191處包含氨基酸V(Val)的Km3同種異型。
[0073]本發(fā)明所述的抗體優(yōu)選地包含SEQ ID NO. 1或3中所示的重鏈可變區(qū)和/或SEQ ID NO.2或4中所示的輕鏈可變區(qū)。因此，本發(fā)明所述的抗體優(yōu)選地包含SEQ ID NO.1中所示的 重鏈可變區(qū)和SEQ ID NO. 2中所示的輕鏈可變區(qū)，或者包含SEQ ID NO. 3中所示的重鏈可變 區(qū)和SEQ ID N0.4中所示的輕鏈可變區(qū)。
[0074] 本發(fā)明所述的抗體優(yōu)選地包含SEQ ID NO. 1中所示的重鏈可變區(qū)、SEQ ID N0.2中 所示的輕鏈可變區(qū)、重鏈恒定區(qū)即SEQ ID NO.6中所示的氨基酸序列和輕鏈恒定區(qū)即SEQ ID NO.7中所示的氨基酸序列。
[0075] 或者，本發(fā)明所述的抗體優(yōu)選地包含SEQ ID NO. 3中所示的重鏈可變區(qū)、SEQ ID NO.4中所示的輕鏈可變區(qū)、重鏈恒定區(qū)即SEQ ID NO.6中所示的氨基酸序列和輕鏈恒定區(qū) 即SEQ ID N0.7中所示的氨基酸序列。
[0076]本發(fā)明所述的抗體優(yōu)選地與根據(jù)SEQ ID N0.5的人Fey RIIB的第20-40號(hào)氨基酸 范圍內(nèi)的表位特異性結(jié)合。
[0077]本文所用術(shù)語(yǔ)"表位"是指抗體與其特異性結(jié)合的賦予在動(dòng)物體內(nèi)免疫原性活性 的多肽或蛋白質(zhì)的一部分。
[0078] 更優(yōu)選地，所述抗體與包含SEQ ID N0.5中的基序GTHSPES的表位特異性結(jié)合。已 經(jīng)表明，該氨基酸基序是Fc γ RIIB的非常特異的表位。與該表位特異性結(jié)合的抗體不與人 Fc γ RIIA結(jié)合。優(yōu)選地，本發(fā)明所述的抗體通過(guò)其可變區(qū)與該表位的結(jié)合不會(huì)干擾抗體的 Fc部分與所述受體的結(jié)合并且不會(huì)阻斷所述受體的正常生理功能。
[0079]優(yōu)選地，本發(fā)明所述的抗體在體外以具有至少4.9χ ΗΓ4，1的解離速率（off-rate)常數(shù)的親和性結(jié)合人FcyRIIb。解離速率常數(shù)(k Qff)可通過(guò)表面等離子體共振實(shí)驗(yàn)進(jìn) 行測(cè)量。特別是，與sFc yRIIB結(jié)合的抗體可通過(guò)使用BIAcore T200生物傳感器（GE Healthcare/BIAcore)的表面等離子體共振來(lái)分析。
[0080]本文所用術(shù)語(yǔ)"親和性"是指抗體或其片段或其衍生物的一個(gè)重鏈和一個(gè)輕鏈的 可變區(qū)與其抗原（例如Fc γ RIIB受體)之間的結(jié)合強(qiáng)度，并且在體外進(jìn)行測(cè)量。親和性決定 了表位與抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)之間相互作用的強(qiáng)度?？梢允褂靡韵鹿接?jì)算親和性：
[0081 ] KA = [AB-AG]/[AB]*[AG] = kon/koff
[0082] 其中：
[0083] KA =親和性常數(shù)；
[0084] [AB]=抗體上未被占用的結(jié)合位點(diǎn)的摩爾濃度
[0085] [AG]=抗原上未被占用的結(jié)合位點(diǎn)的摩爾濃度
[0086] [AB-AG]=抗體-抗原復(fù)合物的摩爾濃度
[0087]本文所用術(shù)語(yǔ)"親合力(avidity)"是指抗體-抗原復(fù)合物的整體強(qiáng)度的測(cè)量值，其 實(shí)際上取決于以下參數(shù)：（1)抗體對(duì)表位的親和力，（2)抗體和抗原的效價(jià)，和(3)相互作用 部分的結(jié)構(gòu)布置。
[0088] 本發(fā)明還提供了編碼本文所述的抗體的核酸序列。本文所用術(shù)語(yǔ)"核酸"或"核苷 酸序列"是指DNA分子(例如cDNA或基因組DNA)、RNA(mRNA)、其組合或者包含DNA和RNA的雜 合分子。所述核酸可以是雙鏈或單鏈的，還可以同時(shí)包含雙鏈和單鏈的片段。最優(yōu)選的是雙 鏈DNA分子。
[0089] 根據(jù)本發(fā)明，編碼發(fā)明的抗體的核酸序列包含至少編碼賦予根據(jù)本發(fā)明所述的抗 體特異性結(jié)合性質(zhì)的抗體的那些部分的核苷酸。
[0090] 優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明所述的核酸序列編碼所述可變區(qū)，優(yōu)選地至少編碼本文所述 的 CDR〇
[0091] SEQ ID NOs.8-11顯示了根據(jù)本發(fā)明的核酸序列的優(yōu)選的實(shí)例。本領(lǐng)域的技術(shù)人 員能夠知曉，這些核苷酸序列可以根據(jù)所用的表達(dá)方法和所用系統(tǒng)而變化。
[0092] 本發(fā)明進(jìn)一步提供一種核酸載體，其包含至少一種本文所述的編碼本發(fā)明的抗體 的核酸序列。所述載體優(yōu)選地包含啟動(dòng)子，上述核酸序列位于所述啟動(dòng)子的控制下。所述載 體可以是原核或真核表達(dá)載體，其中重組核酸或單獨(dú)表達(dá)或與其他肽或蛋白融合表達(dá)。
[0093] 本發(fā)明還提供一種用上述載體轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。所述宿主細(xì)胞可以是任何細(xì)胞、 原核細(xì)胞或者真核細(xì)胞，并且可用于至少產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明所述的抗體或其片段或衍生物的 部分。
[0094] 本發(fā)明還提供一種用于產(chǎn)生本發(fā)明所述的抗體的方法，所述方法包括在允許表達(dá) 被本發(fā)明所述的核酸載體包含的核酸序列的條件下培養(yǎng)本文所述的宿主細(xì)胞，并回收如此 產(chǎn)生的抗體。
[0095] 根據(jù)本發(fā)明所述的抗體或其片段或衍生物可有利地用于藥物組合物。該藥物組合 物可應(yīng)用于治療或預(yù)防疾病或障礙，優(yōu)選自身免疫性疾病。
[0096] 根據(jù)本發(fā)明所述的Fc γ RIIB特異性抗體抑制B細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和活化的粒細(xì)胞 (例如巨噬細(xì)胞）中的免疫反應(yīng)，這引起免疫刺激介質(zhì)的產(chǎn)量降低，并使抗體的產(chǎn)量以及抗 原呈遞降低(例如，在樹突狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞上導(dǎo)致Τ細(xì)胞募集減少）?？傊?，所述抗體產(chǎn)生 的反饋環(huán)和免疫系統(tǒng)的再刺激是被抑制的。
[0097]重要的是，本發(fā)明所述的Fey RIIB抗體通過(guò)其可變區(qū)與受體的結(jié)合不會(huì)干擾1C或 抗體與所述受體的Fc片段結(jié)合，并且與已知的阻斷性抗體相對(duì)照，保持了 Fc受體的正常功 能。
[0098]因此，另一方面，本發(fā)明涉及包含根據(jù)本發(fā)明所述的抗體或其片段或衍生物作為 活性成分的藥物組合物。所述藥物組合物可以包含至少一種藥學(xué)上可接受的載體或佐劑或 賦形劑。
[0099]抗體可以在本領(lǐng)域已知的或列于公認(rèn)的用于動(dòng)物、更特別地用于人的藥典中的藥 學(xué)上可接受的組合物中提供。
[0100] 所述組合物，如果需要，還可以包含少量的潤(rùn)濕劑或乳化劑或pH緩沖劑。這些組合 物可以采取溶液、混懸液、乳液、片劑、丸劑、膠囊劑、粉末、緩釋試劑等的形式。
[0101] 本發(fā)明所述的組合物可以配制為中性或鹽的形式。
[0102] 藥學(xué)上可接受的鹽包括但不限于與諸如衍生自鹽酸、磷酸、醋酸、草酸、酒石酸等 的那些陰離子形成的鹽，和與諸如衍生自鈉、鉀、銨、鈣、氫氧化鐵、異丙胺、三乙胺、2-乙胺 乙醇、組氨酸、普魯卡因等的那些陽(yáng)離子形成的鹽。
[0103] 上述藥物組合物可用于治療或預(yù)防或診斷任何疾病或障礙，優(yōu)選自身免疫性疾 病，最優(yōu)選特征在于產(chǎn)生自身抗體的自身免疫性疾病。
[0104] 所述術(shù)語(yǔ)"治療有效的"和"預(yù)防有效的"涵蓋了施用的劑量和頻率。施用劑量和頻 率會(huì)進(jìn)一步典型地根據(jù)對(duì)每個(gè)患者特定的因素而變化，具體取決于施用的特定治療性或預(yù) 防性制劑、疾病種類、施藥途徑以及患者的年齡、體重、反應(yīng)和既往病史。本領(lǐng)域的技術(shù)人員 能夠選擇合適的方案。本文所用術(shù)語(yǔ)"治療有效量"是指足以治療或改善疾病或障礙、推遲 疾病發(fā)作或在疾病的治療或管理中提供任何治療有益效果的所述治療活性組分或試劑的 量。
[0105] 對(duì)于本發(fā)明涵蓋的抗體，給患者施用的劑量典型地為0.000111^/1^至10011^/1^患 者體重。優(yōu)選地，所述施用劑量為約15mg/kg。眾所周知，人抗體在人體內(nèi)的半衰期要比來(lái)自 其他物種的抗體長(zhǎng)。因此，與來(lái)自其他物種的抗體通常所用的劑量相比，本發(fā)明所述的抗體 或其片段或衍生物的施用劑量和頻率可以降低。
[0106] 用治療或預(yù)防有效量的本發(fā)明所述的抗體或其片段或衍生物對(duì)患者進(jìn)行治療可 以包括單次治療，或者優(yōu)選地可以包括一系列治療。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，可以用約0.1 至30mg/kg體重范圍內(nèi)的本發(fā)明所述的抗體或其片段或衍生物對(duì)患者進(jìn)行治療，達(dá)每周一 次、約1至10周、優(yōu)選地2至8周、更優(yōu)選地約3至7周。可以選擇最有利的應(yīng)用形式和方法以最 有益于待治療的患者。
[0107] 施用本發(fā)明所述的抗體或其片段或衍生物的方法包括但不限于腸胃外給藥(例如 皮內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)和皮下）、硬膜外和粘膜給藥(例如鼻內(nèi)和口服途徑）。在一個(gè) 特殊的實(shí)施方案中，肌肉內(nèi)、靜脈內(nèi)或皮下施用本發(fā)明所述的抗體。可以通過(guò)任何方便的途 徑施用所述組合物，例如，通過(guò)輸液注射或彈丸注射、通過(guò)上皮或皮膚黏膜襯里(例如口腔 黏膜、直腸粘膜和腸粘膜等），還可以與其他生物活性劑一起施用?？梢匀砘蚓植渴┯?。此 外，還可以采用肺部施用，例如通過(guò)使用吸入器或噴霧器以及具有霧化劑的制劑。
[0108] 本文所用術(shù)語(yǔ)"處理"和"治療"是指對(duì)患者施用治療有效量的根據(jù)本發(fā)明所述的 藥物組合物。"治療有效量"是指足以治療或改善疾病或障礙、推遲疾病發(fā)作或在疾病的治 療或管理中提供任何治療有益效果的所述藥物組合物或抗體的量。
[0109] 本文所用術(shù)語(yǔ)"預(yù)防"是指用于預(yù)防疾病或障礙發(fā)作的試劑的使用。"預(yù)防有效量" 定義足以預(yù)防疾病的發(fā)作或復(fù)發(fā)的所述活性組分或藥劑的量。
[0110] 本文所用術(shù)語(yǔ)"障礙"和"疾病"交替使用，用以指代受試者的病況。特別地，所述術(shù) 語(yǔ)"自身免疫性疾病"與術(shù)語(yǔ)"自身免疫性障礙"可互換使用，用以指受試者的具有以下特征 的病況：由受試者對(duì)其自身細(xì)胞、組織和/或器官的免疫性反應(yīng)引起的細(xì)胞、組織和/或器官 損傷。
[0111]此外，本發(fā)明所述的抗體可用于診斷的目的以檢測(cè)、診斷或監(jiān)控疾病或障礙，特別 是自身免疫性疾病。根據(jù)本發(fā)明所述的抗體或其片段或衍生物可用于通過(guò)本文所述的或本 領(lǐng)域技術(shù)人員已知的經(jīng)典的免疫組化方法測(cè)定生物學(xué)樣品中的Fc γ RIIB水平（例如參見(jiàn) Jalkanen等，1985,J.Cell.Biol.101:976-985;Jalkanen等，1987,J.Cell.Biol.105:3087-3096)。其他用于檢測(cè)蛋白基因表達(dá)的基于抗體的方法包括免疫測(cè)定，諸如酶聯(lián)免疫吸附測(cè) 定(ELISA)和放射性免疫測(cè)定(RIA)。
[0112]因此，本發(fā)明進(jìn)一步涉及包含本發(fā)明所述抗體的診斷組合物。
[0113]本文所用術(shù)語(yǔ)"診斷（的)"是指用于診斷與自身免疫性疾病相關(guān)的FcyRIIB的存 在的發(fā)明抗體的任何用途，例如對(duì)內(nèi)源Fc γ RIIB在個(gè)體或患者細(xì)胞上的表面表達(dá)的量或程 度的測(cè)定。其還指活化性Fc γ RII與抑制性Fc γ RII的比率測(cè)定，例如表達(dá)的Fc γ RIIA與Fc γ RIIB的比率。
[0114] 在本發(fā)明所述的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，上述診斷組合物用于檢測(cè)和診斷任何疾病 或障礙，特別是特征在于產(chǎn)生自身抗體的自身免疫性疾病。示例性的自身免疫性疾病包括 免疫性血小板減少癥、全身性紅斑狼瘡、惡性貧血、艾迪生病、1型糖尿病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、 干燥綜合征、皮膚肌炎、多發(fā)性硬化癥、重癥肌無(wú)力、Reiter綜合征、格氏病、尋常型和大皰 性天皰瘡、自身免疫性肝炎、潰瘍性結(jié)腸炎、冷凝集素病、自身免疫性周圍神經(jīng)病變，但不限 于這些。
[0115] 在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的抗體用于人的自身免疫性疾病的診斷。例 如，根據(jù)本發(fā)明所述的抗體可用于測(cè)定患有自身免疫性疾病的個(gè)體細(xì)胞上的Fc γ RIIB表面 表達(dá)。優(yōu)選地，使用所述抗體在FACS分析中檢測(cè)Fc γ RIIB在B細(xì)胞或漿B細(xì)胞上的表達(dá)。對(duì) 此，可以通過(guò)標(biāo)記物試劑、熒光標(biāo)記物或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何其他標(biāo)記物來(lái)修飾所 述抗體以便能夠使用標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)本發(fā)明所述的抗體還可以與本領(lǐng)域已知的人 FcyRIIA特異性抗體相組合來(lái)用作診斷工具。因此，可以測(cè)定FcyRIIB和患有自身免疫性 疾病或炎性疾病的個(gè)體的細(xì)胞上的Fc γ RIIB的表達(dá)，也可以計(jì)算出比率作為所述疾病狀態(tài) 或疾病進(jìn)展的標(biāo)志，或者作為用于診斷所述疾病的標(biāo)志。
[0116] 本發(fā)明進(jìn)一步提供一種用于檢測(cè)自身免疫性疾病的診斷試劑盒，其包含根據(jù)本發(fā) 明所述的抗體或其片段或衍生物和可選的標(biāo)記物試劑、載體試劑和/或合適的和需要的容 器。
[0117] 序列
[0118] SEQ ID Ν0.1:大鼠抗體8Α6的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列
[0119] SEQ ID N0.2:大鼠抗體8A6的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列 [0120] SEQ ID從).3:人源化抗體1111846的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列
[0121] SEQ ID從).4:人源化抗體1111846的輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列
[0122] SEQ ID從).5:人？〇丫1?118的氨基酸序列
[0123] SEQ ID從).6:人源化抗體1111846_被的重鏈恒定區(qū)的氨基酸序列
[0124] SEQ ID從).7:人源化抗體1111846_被的輕鏈恒定區(qū)的氨基酸序列
[0125] SEQ ID從).8:編碼人源化抗體1111846的重鏈可變區(qū)的核酸序列
[0126] SEQ ID從).9:編碼人源化抗體1111846的輕鏈可變區(qū)的核酸序列
[0127] SEQ ID從).10:編碼人源化抗體1111846_被的重鏈恒定區(qū)的核酸序列
[0128] SEQ ID從).11:編碼人源化抗體1111846_被的輕鏈恒定區(qū)的核酸序列
[0129] SEQ ID從).12:人可溶性?〇丫1?11厶(8?〇丫1?11厶)的氨基酸序列