D-阿洛酮糖3-差向異構酶的改進的變體及其用圖
【專利說明】D-阿洛酮糖3-差向異構酶的改進的變體及其用途 發(fā)明領域
[0001] 本發(fā)明涉及用于從果糖制備阿洛酮糖的改進的異構酶，具體地是D-阿洛酮糖3-差 向異構酶，及其用途。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] D-阿洛酮糖，也稱為D-阿盧糖，是果糖的罕見糖異構體。它可以發(fā)現于自然界中， 像在可食用蘑菇或木菠羅中，在小麥和鼠刺屬植物中，但是處于非常低的濃度。
[0004] 與果糖相反，人體中阿洛酮糖的代謝是被部分吸收并且以能量代謝，并且部分地 在尿中和在糞便中未改變地被排出。
[0005] 已經披露了 D-阿洛酮糖作為用于預防生活方式相關疾病的材料的特征，包括其無 熱量性質，對減小升糖反應的正效應，減肥作用，等。此外，D-阿洛酮糖的甜度是蔗糖的甜度 的約70% (大島（Oshima)，等人(2006)不同食物產品中的阿洛酮糖含量及其來源(Psicose contents in various food products and its origin).食品科學技術研究（Food Sci Technol Res) 12:137-143)，但是僅具有0.3%的蔗糖能量，并且被建議為用于食物產品的 理想蔗糖代用品。它還可以用作肝脂肪生成酶和腸糖苷酶的抑制劑，用于減少體內脂肪 累積。它進一步示出重要的生理機能，例如活性氧種類清除活性和神經保護作用。此外，在 食品加工期間，它還改進了膠凝特性并且產生良好風味。
[0006] D-阿洛酮糖以極小的量存在于商業(yè)碳水化合物或農產品中，并且是難以化學合成 的。因此，對于作為D-阿洛酮糖生產的有吸引力的方式，通過使用D-塔格糖3-差向異構酶 (DTEase)家族酶差向異構化進行D-果糖和D-阿洛酮糖之間的相互轉換已經是困惑的。
[0007] 到目前為止，已經報道了9個類別的DTEase家族酶來源。二十年前，首先由泉森 (Izumori)等人表征了DTEase，來自菊苣假單胞菌(Pseudomonas cichorii )，用D-塔格糖的 最佳底物示出己酮糖的C-3差向異構化活性(泉森（Izumori)等人，1993,生物科學、生物技 術和生物化學（Biosci · Biotechno 1 .Biochem.)57，1037-1039)。直至2006年，從根癌土壤桿 菌(Agrobacterium tumefaciens)鑒定了具有己酮糖的C-3差向異構化活性的第二酶，并且 將其命名為D-阿洛酮糖3-差向異構酶(DPEase)，這是由于它的針對D-阿洛酮糖的高度底物 特異性（金姆（Kim)等人，2006,應用和環(huán)境微生物學（Applied and environmental microbiology)72,981-985;US 2010/0190225、W0 2011/040708)。最近，分別從類球紅細菌 (Rhodobacter sphaero ides) SK0 ll(DTEase)(張（Zhang)等人，2009，生物技術快報 (Biotechnology letters)31，857_862)、解纖維梭菌（Clostridium cellulolyticum)H10 (DPEase)(木(Mu)等人，2011，農業(yè)與食品化學雜志（Journal of agricultural and food chemistry)，59,7785-7792，CN 102373230)、瘤胃球菌屬（Ruminococcus sp)5_l_39BFAA (DPEase)(朱（Zhu)等人，2012，生物技術快報（Bio techno logy let ter s )34，1901-1906)、鮑 氏梭菌(Clostridium bolteae)ATCC BAA-613(賈(Jia)等人，2013,應用微生物學和生物技 術（Applied Microbiology and Biotechnology)D0I 10.1007/s00253-013-4924_8)、閃爍 梭菌（Clostridium scindens)ATCC 35704(張（Zhang)等人，2013，公共科學圖書館雜志 (PLoS 0NE)8，e62987)、和梭菌屬（Clostridium sp)BNLl 100(木(Mu)等人，2013,生物技術 快報（Biotechnology letters)DOI 10.1007/sl0529-013-1230-6)表征了另外六種DTEase 家族酶。此外，丸田（Maruta)等人披露了根瘤菌屬(Rhizobium)中的產DTEase源(US 2011/ 0275138)。
[0008] 只有一篇參考文獻報道了通過蛋白質工程技術，對DTEase家族酶進行了酶修飾。 使用隨機的和定點的誘變技術，崔（Choi)等人（2011，應用和環(huán)境微生物學(Applied and environmental microbiology)77,7316_7320)構建了根癌土壤桿菌DPEase的I33L S213C 雙位點變體，并且與野生型酶相比，該變體酶示出最適溫度、半衰期、熔化溫度、和催化效率 方面的增加。它的最適pH仍在8.00保持不變。
[0009] 然而，對于活性，該酶具有在8.0-9.5的最適pH，并且pH穩(wěn)定性是在8.0-10.0之間， 這并不適合工業(yè)應用。
[0010] 因此，使用阿洛酮糖的主要關注點仍保持在其稀缺性及其生產成本，并且仍存在 對改進的工業(yè)D-阿洛酮糖生產的需要。
[0011] 發(fā)明概述
[0012] 為了發(fā)展工業(yè)D-阿洛酮糖生產并且降低生產成本，優(yōu)化的DTEase家族酶應是弱酸 穩(wěn)定的并且是熱穩(wěn)定的，并且對于底物D-果糖具有更高催化效率和轉換率。
[0013] 本發(fā)明涉及親本D-阿洛酮糖3-差向異構酶的變體，其中該變體包括與該親本D-阿 洛酮糖3-差向異構酶相比由在對應于SEQ ID No 2中位置211的位置處的絲氨酸殘基對甘 氨酸殘基的取代;并且其中該變體具有D-阿洛酮糖3-差向異構酶活性。優(yōu)選地，該親本D-阿 洛酮糖3-差向異構酶具有以下氨基酸序列，該氨基酸序列與選自下組的序列具有60%或更 高的同一性，該組由以下各項組成:SEQ ID No 2和5-10,更優(yōu)選地，與選自下組的序列具有 70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%或更高的同一性，該組由以下各項組成 ：SEQID No 2和5-10〇
[0014] 在一個優(yōu)選實施例中，該變體具有一個或若干個以下特征：
[0015] a.與該親本D-阿洛酮糖3-差向異構酶相比，具有更低的pH最佳值，優(yōu)選地是在6至 7的范圍內；和/或
[0016] b.與該親本-阿洛酮糖3-差向異構酶相比，具有對底物D-果糖的更高催化效率，優(yōu) 選地高至少兩倍;和/或
[0017] c.與該親本-阿洛酮糖3-差向異構酶相比，具有在60°C更長的半衰期。
[0018] 優(yōu)選地，該變體具有以下氨基酸序列，該氨基酸序列與SEQ ID N〇2具有35%或更 高的同一性，優(yōu)選60%或更高的同一性，更優(yōu)選至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或更 尚的同一性。
[0019] 優(yōu)選地，該變體具有以下氨基酸序列，該氨基酸序列與選自下組的序列具有60% 或更高的同一性，該組由以下各項組成:SEQ ID No 2和5-10,優(yōu)選地更優(yōu)選地，與選自下組 的序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或更高的同一性，該組由以下各項組成： SEQ ID No 2和5-10。
[0020] 在一個優(yōu)選實施例中，該親本D-阿洛酮糖3-差向異構酶是選自：來自菊苣假單胞 菌的D-塔格糖3-差向異構酶、來自根癌土壤桿菌的D-阿洛酮糖3-差向異構酶、來自梭菌屬 的D-阿洛酮糖3-差向異構酶、來自閃爍梭菌的D-阿洛酮糖3-差向異構酶、來自鮑氏梭菌的 D-阿洛酮糖3-差向異構酶、來自瘤胃球菌屬的D-阿洛酮糖3-差向異構酶、和來自解纖維梭 菌的D-阿洛酮糖3-差向異構酶。更優(yōu)選地，該親本D-阿洛酮糖3-差向異構酶是來自解纖維 梭菌的D-阿洛酮糖3-差向異構酶。
[0021] 在一個最優(yōu)選實施例中，該變體包括SEQ ID No 4的氨基酸序列或由其組成，或包 括以下氨基酸序列或由其組成，該氨基酸序列與SEQ ID No 4具有90%或95%或更高的同 一性，并且在位置211處具有殘基絲氨酸。
[0022] 在一個替代性優(yōu)選實施例中，該變體包括以下項或由其組成：
[0023]-具有G211S取代的SEQ ID No 5的氨基酸序列，或以下氨基酸序列，該氨基酸序列 與SEQ ID No 5具有90%或95%或更高的同一性并且在位置211處具有殘基Ser;或者 [0024]-具有G210S取代的SEQ ID No 6的氨基酸序列，或以下氨基酸序列，該氨基酸序列 與SEQ ID No 6具有90%或95%或更高的同一性并且在位置210處具有殘基Ser;或者 [0025]-具有G211S取代的SEQ ID No 7的氨基酸序列，或以下氨基酸序列，該氨基酸序列 與SEQ ID No 7具有90%或95%或更高的同一性并且在位置211處具有殘基Ser;或者 [0026]-具有G213S取代的SEQ ID No 8的氨基酸序列，或以下氨基酸序列，該氨基酸序列 與SEQ ID No 8具有90%或95%或更高的同一性并且在位置213處具有殘基Ser;或者 [0027]-具有G223S取代的SEQ ID No 9的氨基酸序列，或以下氨基酸序列，該氨基酸序列 與SEQ ID No 7具有90%或95%或更高的同一性并且在位置223處具有殘基Ser;或者 [0028]-具有G213S取代的SEQ ID No 10的氨基酸序列或以下氨基酸序列，該氨基酸序列 與SEQ ID No 10具有90%或95%或更高的同一性并且在位置213處具有殘基Ser。
[0029] 本發(fā)明的另一個目標是編碼根據本發(fā)明的變體的分離的核酸。本發(fā)明進一步涉及 包括編碼根據本發(fā)明的變體的核酸的表達盒或重組表達載體。它還涉及包含根據本發(fā)明的 核酸、根據本發(fā)明的表達盒或根據本發(fā)明的重組表達載體的重組宿主細胞。優(yōu)選地，將編碼 根據本發(fā)明的變體的核酸整合進該宿主細胞的染色體中。在一個具體實施例中，該宿主細 胞是GRAS菌株（公認安全），優(yōu)選地是枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。在一些實施例 中，該重組宿主細胞是枯草芽孢桿菌菌株，其中編碼桿菌肽酶F的基因是失活的。
[0030] 本發(fā)明涉及用于生產D-阿洛酮糖3-差向異構酶變體的方法，該方法包括培養(yǎng)根據 本發(fā)明的重組宿主細胞，并且任選地從所得培養(yǎng)物回收或純化產生的D-阿洛酮糖3-差向異 構酶變體。換言之，它涉及根據本發(fā)明所述的重組宿主細胞用于產生根據本發(fā)明的D-阿洛 酮糖3-差向異構酶變體的用途。
[0031] 本發(fā)明還涉及用于產生D-阿洛酮糖的方法，包括在適合D-阿洛酮糖3-差向異構酶 活性的條件下，使根據本發(fā)明的變體與D-果糖接觸，并且任選地回收產生的D-阿洛酮糖。任 選地，D-果糖是由葡糖異構酶從D-葡萄糖預先地或同時地產生的。然后，本發(fā)明涉及根據本 發(fā)明的D-阿洛酮糖3-差向異構酶變體或根據本發(fā)明的重組宿主細胞用于產生D-阿洛酮糖 的用途。
[0032] 本發(fā)明的一個目標是一種酶組合物，該酶組合物包括根據本發(fā)明的D-阿洛酮糖3-差向異構酶變體和另外的酶，該另外的酶特別是葡糖異構酶。
[0033] 最后，本發(fā)明涉及根據本發(fā)明的GRAS宿主細胞用于制備食物產品的用途，并且涉 及包括這樣一種GRAS宿主細胞的食物產品。
[0034]發(fā)明詳細說明
[0035]本發(fā)明涉及D-阿洛酮糖3-差向異構酶的改進的變體。
[0036]
[0037] 在本文件中，術語"DPEase"和"DTEase"分別可以用于代替"D-阿洛酮糖3-差向異 構酶"和"D-塔格糖3-差向異構酶"。并且"DPEase"和"DTEase"分別意指具有為D-阿洛酮糖 和D-塔格糖的最佳底物的酮醣3-差向異構酶。
[0038] 術語"親本"意指對其進行改變以產生本發(fā)明的變體的酶。親本可以是天然存在的 (野生型）多肽或其片段的變體。在一個優(yōu)選實施例中，該親本D-阿洛酮糖3-差向異構酶是 在SEQ ID No 2和5-10中示出的那些之間選擇的一個D-阿洛酮糖3-差向異構酶。
[0039] 此外，術語"DPEase變體"還可以是指如在本發(fā)明中傳授的D-塔格糖3-差向異構酶 的變體。同一性百分比：通過比較窗口，通過比較以最佳方式比對的兩個序列，來確定兩個 氨基酸序列(A)和(B)之間的"百分比同一性"?？梢酝ㄟ^熟知的方法，例如使用用于尼德爾 曼(Needleman)-翁施(Wunsch)的總體比對的算法，來進行序列的所述比對。蛋白分析軟件 使