小麥抗病相關(guān)蛋白TaCAD12及其相關(guān)生物材料與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物技術(shù)領(lǐng)域中小麥抗病相關(guān)蛋白TaCAD12及其相關(guān)生物材料與應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 小麥(Triticuma aestivum)是人類賴W生存的四大作物之一，世界上1/3W上的 人口 W小麥為主食，小麥的產(chǎn)量與品質(zhì)直接影響著人類的生存與生活質(zhì)量。隨著耕作制度、 肥水條件和氣候條件等因素的改變，±傳病害紋枯病在我國(guó)小麥生產(chǎn)區(qū)呈加重發(fā)生態(tài)勢(shì)， 已成為制約小麥高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)的重要因素之一。
[0003] 小麥紋枯病，也稱為小麥尖眼斑病(wheat sharp eyespot)，是由腐生營(yíng)養(yǎng)型病原 真菌禾谷絲核菌(I?lizoctoniacerealis)CAG-巧日立枯絲核菌(I?lizoctoniasolani)AG4、 AG5融合群引起的一種世界性小麥±傳真菌病害。我國(guó)小麥紋枯病主要病原菌為禾谷絲核 菌(化izoctonia cerealis)。紋枯病一般可使小麥減產(chǎn)10%~30%，嚴(yán)重地塊則使小麥減 產(chǎn)50% W上。據(jù)全國(guó)農(nóng)技推廣站報(bào)道，2005-2011年我國(guó)小麥紋枯病每年發(fā)生面積約1億 畝，經(jīng)濟(jì)損失達(dá)數(shù)十億元W上，已成為我國(guó)小麥主產(chǎn)區(qū)小麥第一大病害。因此，選育和推廣 抗性的小麥品種是防治小麥病害流行的最經(jīng)濟(jì)、安全和有效的途徑，對(duì)于保證我國(guó)小麥高 產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)非常重要。然而，由于小麥紋枯病抗性均由多基因控制，缺乏理想的小麥抗病種質(zhì) 資源，常規(guī)育種方法在選育對(duì)紋枯病抗性小麥品種方面的研究進(jìn)展緩慢。分子生物學(xué)和基 因工程的發(fā)展為植物抗性育種開(kāi)辟了一條新途徑。植物抗性蛋白基因的分離克隆與功能分 析，對(duì)闡明植物抗性機(jī)制、有效地進(jìn)行分子育種研究十分必要，已成為國(guó)內(nèi)外植物科學(xué)研究 的熱點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是如何提高植物的抗病性。
[0005] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明首先提供了名稱為抗病相關(guān)蛋白（TaCAD12)的蛋白 質(zhì)，該蛋白質(zhì)為如下A1)、A2)或A3):
[0006] A1)氨基酸序列是序列2的蛋白質(zhì)；
[0007] A2)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或 缺失和/或添加且與植物抗病性相關(guān)的蛋白質(zhì)；
[000引A3)在A1)或A2)的N端或/和C端連接標(biāo)簽得到的融合蛋白質(zhì)。
[0009] 其中，序列2由371個(gè)氨基酸殘基組成。
[0010] 為了使A1)中的蛋白質(zhì)便于純化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的 蛋白質(zhì)的氨基末端或簇基末端連接上如表1所示的標(biāo)簽。
[00川表1、標(biāo)簽的序列
[0012]

[0013] 上述A2)中的化CAD12蛋白質(zhì)，所述一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或 添加為不超過(guò)10個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。
[0014] 上述A2)中的化CAD12蛋白質(zhì)可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表 達(dá)得到。
[001引上述A2)中的TaCAD12蛋白質(zhì)的編碼基因可通過(guò)將序列1的第79-1194位所示的DNA 序列中缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)堿基對(duì)的錯(cuò)義突變， 和/或在其5/端和/或y端連上表1所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。
[0016] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明還提供了與化CAD12相關(guān)的生物材料，該生物材料為 下述B1)至B7)中的任一種：
[0017] B1)編碼TaCAD12的核酸分子；
[001引B2)含有B1)所述核酸分子的表達(dá)盒；
[0019] B3)含有B1)所述核酸分子的重組載體、或含有B2)所述表達(dá)盒的重組載體；
[0020] B4)含有B1)所述核酸分子的重組微生物、或含有B2)所述表達(dá)盒的重組微生物、或 含有B3)所述重組載體的重組微生物；
[0021] B5)含有B1)所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞系、或含有B2)所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因 植物細(xì)胞系；
[0022] B6)含有B1)所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物組織、或含有B2)所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因植 物組織；
[0023] B7)含有B1)所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物器官、或含有B2)所述表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因植 物器官。
[0024] 上述生物才料中，B1)所述核酸分子可為如下bl)-b5)中任一種：
[0025] bl)其編碼序列是序列表中序列1的第79-1194位核巧酸的cDNA分子或DNA分子；
[00%] b2)其編碼序列是序列表中序列1的第79-1392位核巧酸的cDNA分子或DNA分子；
[0027] b3)核巧酸序列是序列表中序列1的DNA分子cDNA分子或DNA分子；
[00巧]b4)與bl)或b2)或b3)限定的核巧酸序列具有75%或75% W上同一性，且編碼 TaCAD 12的cDNA分子或基因組DNA分子；
[0029] b5)在嚴(yán)格條件下與bl)或b2)或b3)限定的核巧酸序列雜交，且編碼TaCAD12的 cDNA分子或基因組DNA分子。
[0030] 其中，所述核酸分子可W是DNA，如cDNA、基因組DNA或重組DNA;所述核酸分子也可 W 是 RNA，如 mRNA 或 hnRNA 等。
[0031] 其中，序列1由1392個(gè)核巧酸組成，其中序列1的第79-1194位核巧酸所示的DNA分 子編碼序列2所示的蛋白質(zhì)。
[0032] 本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可W很容易地采用已知的方法，例如定向進(jìn)化和點(diǎn)突變的方 法，對(duì)本發(fā)明的編碼化CAD12的核巧酸序列進(jìn)行突變。那些經(jīng)過(guò)人工修飾的，具有與本發(fā)明 分離得到的化CAD12的核巧酸序列75%或者更高同一性的核巧酸，只要編碼化CAD12且具有 化CAD12功能，均是衍生于本發(fā)明的核巧酸序列并且等同于本發(fā)明的序列。
[0033] 運(yùn)里使用的術(shù)語(yǔ)"同一性"指與天然核酸序列的序列相似性。"同一性"包括與本發(fā) 明的編碼序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的核巧酸序列具有75%或更高，或85%或 更高，或90%或更高，或95%或更高同一性的核巧酸序列。同一性可W用肉眼或計(jì)算機(jī)軟件 進(jìn)行評(píng)價(jià)。使用計(jì)算機(jī)軟件，兩個(gè)或多個(gè)序列之間的同一性可W用百分比（％)表示，其可W 用來(lái)評(píng)價(jià)相關(guān)序列之間的同一性。
[0034] 上述生物材料中，所述嚴(yán)格條件是在2XSSC，0.1%SDS的溶液中，在68°C下雜交并 洗膜2次，每次5min，又于0.5 X SSC，0.1 % SDS的溶液中，在68 °C下雜交并洗膜2次，每次 15min;或，0.1 X SS陽(yáng)(或0.1 X SSC)、0.1 % SDS的溶液中，65°C條件下雜交并洗膜。
[0035] 上述75%或75%W上同一性，可為80%、85%、90%或95%^上的同一性。
[0036] 上述生物材料中，B2)所述的含有編碼化CAD12的核酸分子的表達(dá)盒(TaCAD12基因 表達(dá)盒），是指能夠在宿主細(xì)胞中表達(dá)化CAD12的DNA，該DNA不但可包括啟動(dòng)化CAD12基因轉(zhuǎn) 錄的啟動(dòng)子，還可包括終止TaCADl 2基因轉(zhuǎn)錄的終止子。進(jìn)一步，所述表達(dá)盒還可包括增強(qiáng) 子序列?？捎糜诒景l(fā)明的啟動(dòng)子包括但不限于:組成型啟動(dòng)子，組織、器官和發(fā)育特異的啟 動(dòng)子，和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。啟動(dòng)子的例子包括但不限于:花挪菜花葉病毒的組成型啟動(dòng)子35S: 來(lái)自西紅柿的創(chuàng)傷誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，亮氨酸氨基膚酶("LAP",化ao等人（1999)Plant Physiol 120:979-992);來(lái)自煙草的化學(xué)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，發(fā)病機(jī)理相關(guān)1 (PRl)(由水楊酸和BTH(苯并 嚷二挫-7-硫代徑酸S-甲醋)誘導(dǎo)）；西紅柿蛋白酶抑制劑II啟動(dòng)子(PIN2)或LAP啟動(dòng)子(均 可用萊莉酬酸甲醋誘導(dǎo)）；熱休克啟動(dòng)子(美國(guó)專利5，187,267);四環(huán)素誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(美國(guó) 專利5,057,422);種子特異性啟動(dòng)子，如谷子種子特異性啟動(dòng)子口。128化化010631398(中國(guó) 專利200710099169.7))，種子膽存蛋白質(zhì)特異的啟動(dòng)子(例如，菜豆球蛋白、11曰口111，〇16〇3111 和大豆beta conglycin的啟動(dòng)子(Beachy等人（1985化MB0 1.4:3047-3053))。它們可單獨(dú) 使用或與其它的植物啟動(dòng)子結(jié)合使用。此處引用的所有參考文獻(xiàn)均全文引用。合適的轉(zhuǎn)錄 終止子包括但不限于:農(nóng)桿菌姻脂堿合成酶終止子(N0S終止子）、花挪菜花葉病毒CaMV 35S 終止子、tml終止子、魏豆rbcS E9終止子和姻脂氨酸和章魚(yú)氨酸合酶終止子（參見(jiàn)，例如： Odell等人（l98日）Nature 313 :810 ;Rosenberg等人（1987)Gene , 56 :125;加 erineau等人 (1991 )Mol .Gen. Genet, 262:141 ;P;roudfoot( 1991 )Cell ,64:671 ;Sanf aeon 等人 Genes Dev. ,5:141 ;Mogen等人（1990)Plant Cel 1,2:1261 ;Munroe等人（1990)Gene,91:151; Ballad等人（1989)Nucleic Acids Res.17:7891;JosM等人（1987)Nucleic Acid Res., 15:9627)。
[0037] 可用現(xiàn)有的表達(dá)載體構(gòu)建含有所述化CAD12基因表達(dá)盒的重組載體。所述植物表 達(dá)載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。如pAHC25、pBin438、 pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或 pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司）等。所述植物表達(dá)載體還可包含外源基因的3/端非翻譯區(qū) 域，即包含聚腺巧酸信號(hào)和任何其它參與mRNA加工或基因表達(dá)的DNA片段。所述聚腺巧酸信 號(hào)可引導(dǎo)聚腺巧酸加入到mRNA前體的3/端，如農(nóng)桿菌冠瘦瘤誘導(dǎo)(Ti)質(zhì)?；颍ㄈ缫鲋瑝A 合成酶基因 Nos)、植物基因（如大豆膽存蛋白基因）3/端轉(zhuǎn)錄的非翻譯區(qū)均