磁珠預(yù)分裝采血管及其對血液dna的預(yù)處理工藝的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種磁珠預(yù)分裝采血管以及利用其對血液樣本便捷的進(jìn)行DNA粗提、存儲和運(yùn)輸?shù)阮A(yù)處理的工藝方法。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著基因組學(xué)及基因測序技術(shù)的快速發(fā)展，尤其是一代基因測序技術(shù)向二代基因測序技術(shù)的發(fā)展，基因測序所需的時(shí)間及成本都獲得了極大下降?；诨驕y序的精準(zhǔn)醫(yī)療正逐漸成為重大疾病診斷、個(gè)性化醫(yī)療、胎兒遺傳病學(xué)分析和個(gè)體識別等領(lǐng)域的基本手段。人體DNA最主要的來源之一就是血液，如:存在于血細(xì)胞中的基因組DNA、存在于血液中但游離于血細(xì)胞之外的游離DNA(cfDNA)、來自于腫瘤細(xì)胞的DNA(CtDNA)、以及孕婦血液中來自于胎兒的DNA，因此對血液DNA進(jìn)行提取和檢測，即液體活檢(Liquid B1psy)，是重大疾病伴隨診斷、胎兒遺傳病診斷、基因克隆、基因測序、核酸疫苗、基因治療和各種基因重組技術(shù)等領(lǐng)域的有力手段。
[0003]傳統(tǒng)血液DNA的提取和檢測包括如下幾個(gè)步驟:1、血液樣品的采集、運(yùn)輸和保存；
2、血液樣品中DNA的提取和純化;3、對血液樣品中DNA進(jìn)行測序等分析化驗(yàn)。其中第I步和第2步的目的為獲取目標(biāo)DNA，現(xiàn)階段在獲取目標(biāo)DNA的工作中，眾多研究者主要關(guān)注第2步，即如何更好提取、分離和純化血液樣品中DNA，而實(shí)際上第I個(gè)步驟也極大影響著DNA的提取和純化效率。步驟I大致過程如下:在醫(yī)院進(jìn)行血樣采集，裝入已經(jīng)加入抗凝劑的特定采血管，如果檢測對象為豐度極低的cfDNA或CtDNA，為避免基因組的干擾，采血管中還需要加入能夠防止血細(xì)胞破裂的保護(hù)劑;隨后將所采集血樣運(yùn)輸至檢測地點(diǎn)，一般來講需要進(jìn)行低溫并在特定的器皿中進(jìn)行血液樣品的運(yùn)輸和保存，為防止運(yùn)輸和保存過程中DNA發(fā)生降解，還需要在采血管中加入特殊保護(hù)劑以保證血液中DNA的穩(wěn)定性和完整性。步驟2是在實(shí)驗(yàn)室將上述采集到的血液樣品用相應(yīng)的核酸提取試劑盒進(jìn)行目標(biāo)DNA的分離和純化，常用的方法有柱式法和磁珠法。為保證目標(biāo)DNA穩(wěn)定和減少分解，甚至需要從采血開始到目標(biāo)DNA的提取在2個(gè)小時(shí)內(nèi)完成，對血液樣本的運(yùn)輸距離、運(yùn)輸條件和運(yùn)輸方式要求極高。
[0004]傳統(tǒng)方法在此過程中有較大的局限性:1、當(dāng)前用于進(jìn)行DNA，尤其是cfDNA和CtDNA檢測，血樣采集、運(yùn)輸和保存需要使用特殊采血管，采血管中添加有針對血細(xì)胞層面防止血細(xì)胞破裂的保護(hù)劑、防止DNA降解的保護(hù)劑、以及抗凝劑等，成本高昂，一般來講每只采血管的成本要在200元左右;2、后期的儲存和運(yùn)輸條件要求苛刻，血液原始樣品不易保存，保存時(shí)間有限，越長的運(yùn)輸時(shí)間會造成越多的DNA降解發(fā)生，導(dǎo)致接下來DNA提取的完整性、穩(wěn)定性、數(shù)量都將有所下降。如果血樣采集地點(diǎn)在邊遠(yuǎn)地區(qū)，如山區(qū)和西部等落后地區(qū)，由于路途較遠(yuǎn)，運(yùn)輸時(shí)間長，即使使用昂貴的采血裝備也難以實(shí)施。3、如果血樣需要冷凍運(yùn)輸，血液樣品的反復(fù)凍融則會極大損害血液樣品中DNA的穩(wěn)定性，影響檢測結(jié)果。
[0005]綜上所述，血液和血液DNA保存、運(yùn)輸和提取中存在諸多問題，有必要開發(fā)一種更加便捷的血液DNA的預(yù)處理工藝及相關(guān)設(shè)備，能夠在現(xiàn)場快速采取血樣后進(jìn)行預(yù)處理，以便于后期的運(yùn)輸和存儲，并適合后期血液DNA純化的快速、自動化、高通量的要求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]針對現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，本發(fā)明的目的在于提供一種磁珠預(yù)分裝采血管以及利用其對血液樣本便捷的進(jìn)行DNA粗提、存儲和運(yùn)輸?shù)姆椒?。其將DNA提取純化的部分工作向前整合到血樣采集步驟中，直接從新鮮血液中對目標(biāo)DNA進(jìn)行初步富集，并在外加磁場的作用下使之與血液中其它雜質(zhì)實(shí)現(xiàn)分離，對DNA進(jìn)行有針對性的穩(wěn)定化后用于運(yùn)輸和存儲，將傳統(tǒng)的血液樣品運(yùn)輸轉(zhuǎn)化為DNA樣本運(yùn)輸，DNA樣本的保存和運(yùn)輸可實(shí)現(xiàn)在常溫環(huán)境下進(jìn)行，避免了血液樣本所需要的冷鏈運(yùn)輸?shù)瓤量虠l件;并且與血液樣本直接運(yùn)輸相比較，能夠更好的保證DNA的穩(wěn)定性和完整性，避免了血樣長時(shí)間運(yùn)輸中容易出現(xiàn)的DNA降解現(xiàn)象，方法更加簡便和高效。
[0007]本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下:
[0008]一種磁珠預(yù)分裝采血管，其特征在于，在市售的普通的采血管中提前預(yù)分裝入磁珠，所述磁珠具有超順磁性，且磁珠表面修飾有對DNA具有富集作用的基團(tuán)，粒徑為納米級或者微米級材料。
[0009]優(yōu)選的是，所述的磁珠預(yù)分裝采血管，其中，所述采血管中還預(yù)分裝入必要的具有特定功能的預(yù)處理液。
[0010]優(yōu)選的是，所述的磁珠預(yù)分裝采血管，其中，所述預(yù)分裝入的特定功能的預(yù)處理液組分主要如下:離液鹽、鈉鹽、表面活性劑、PH調(diào)節(jié)劑、核酸保護(hù)劑、蛋白變性劑、醇類或其組合，預(yù)處理液可針對血液中不同目標(biāo)DNA類型而不同，比如目標(biāo)檢測DNA為cfDNA或者CtDNA，則預(yù)處理液中包含有細(xì)胞穩(wěn)定劑，它用于防止血細(xì)胞破裂引入基因組DNA干擾;如果目標(biāo)檢測DNA為基因組DNA，則預(yù)處理液中包含有裂解劑，它使得血細(xì)胞裂解釋放基因組DNA的同時(shí)實(shí)現(xiàn)DNA與磁珠的結(jié)合。
[0011]優(yōu)選的是，所述具有特定功能的預(yù)處理液中的離液鹽可以是鹽酸胍、異硫氰酸胍、碘化鈉中的一種或者兩種混合。
[0012]優(yōu)選的是，所述具有特定功能的預(yù)處理液中的鈉鹽可以是氯化鈉、硫酸鈉、碳酸鈉中、高氯酸鈉的任意一種。
[0013]優(yōu)選的是，所述具有特定功能的預(yù)處理液中的表面活性劑可以是Tritonx_100、Tween-20、十二燒基硫酸鈉、十二燒基磺酸鈉、十二燒基苯磺酸鈉中的任意一種。
[0014]優(yōu)選的是，所述具有特定功能的預(yù)處理液中的核酸保護(hù)劑可以是EDTA。
[0015]優(yōu)選的是，所述的磁珠預(yù)分裝采血管，其中，所述磁珠的濃度為2-5mg/mL。
[0016]一種采用如上述方案中任一項(xiàng)所述的磁珠預(yù)分裝采血管對血液DNA的預(yù)處理工藝，包括:
[0017]步驟I):將血液樣本裝入所述磁珠預(yù)分裝采血管，混勻，使血液DNA與磁珠結(jié)合；
[0018]步驟2):將所述磁珠預(yù)分裝采血管置于磁力架裝置中進(jìn)行磁性分離，待磁珠被完全吸附后，棄去母液；
[0019]步驟3):在所述磁珠預(yù)分裝采血管中加入清洗液，混勻清洗，磁性分離，待磁珠被完全吸附后，棄去清洗液；
[0020]步驟4):加入DNA穩(wěn)定液、搖勻，即完成對血液DNA的預(yù)處理。
[0021]優(yōu)選的是，所述的預(yù)處理工藝，其中，所述清洗液包括有:鹽酸胍或異硫氰酸胍、異丙醇或乙醇、氯化鈉。
[0022]優(yōu)選的是，所述的預(yù)處理工藝，其中，所述DNA穩(wěn)定液包括有:鹽酸胍或異硫氰酸胍、異丙醇或乙醇、氯化鈉、Tris-HCl;所述DNA穩(wěn)定液的pH值為6-8。
[0023]優(yōu)選的是，所述的預(yù)處理工藝，其中，在步驟4)之后，還包括將所述磁珠預(yù)分裝采血管置于磁性裝置中，使磁珠聚集，以方便存儲和運(yùn)輸。
[0024]本發(fā)明的有益效果是:
[0025]1、本發(fā)明將傳統(tǒng)的血樣采集、血樣運(yùn)輸、實(shí)驗(yàn)室中對血液DNA進(jìn)行提取整個(gè)過程中的部分步驟進(jìn)行重新切割整合，血樣采集完畢后在采血管中即可實(shí)現(xiàn)目標(biāo)DNA與磁珠的結(jié)合完成DNA粗提步驟，然后再將DNA粗提產(chǎn)物運(yùn)輸?shù)綄?shí)驗(yàn)室進(jìn)行后續(xù)純化步驟，將傳統(tǒng)的血液樣本存儲和運(yùn)輸轉(zhuǎn)化為DNA樣本的存儲和運(yùn)輸;DNA樣本的保存和運(yùn)輸可實(shí)現(xiàn)在常溫環(huán)境下進(jìn)行，避免了血液樣本所需要的冷鏈運(yùn)輸?shù)瓤量虠l件;并且與血液樣本直接運(yùn)輸相比較，降低了運(yùn)輸難度，并且能夠更好的保證DNA的穩(wěn)定性和完整性，避免了血樣長時(shí)間運(yùn)輸中容易出現(xiàn)的DNA降解現(xiàn)象，方法更加簡便和高效。
[0026]2、本發(fā)明可通過改變緩沖液類型、磁珠可以提取并保存血液中不同類型DNA，如血液中基因組DNA、cf DNA或者CtDNA等。
[0027]3、本發(fā)明可以避免對血樣品進(jìn)行低溫運(yùn)輸，延長DNA保持完整性的時(shí)間，使得離檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室較遠(yuǎn)的偏遠(yuǎn)地區(qū)的DNA樣本采集、運(yùn)輸和保存成為現(xiàn)實(shí)。
【具體實(shí)施方式】
[0028]下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，以令本領(lǐng)域技術(shù)人員參照說明書文字能夠據(jù)以實(shí)施。
[0029]本案實(shí)施例中所用的磁珠都具有超順磁性，且磁珠表面修飾有對DNA具有富集作用的基團(tuán)；但該基團(tuán)的具體類別不受限定，因?yàn)楦鶕?jù)不同的目標(biāo)DNA，需要采用不同種類的具有特異性吸附富集功能的基團(tuán)。
[0030]實(shí)施例1:
[0031]本實(shí)施方式是一種磁珠預(yù)分裝采血管及其用于便捷血液DNA預(yù)處理(包括:粗提、運(yùn)輸和存儲)的方法，針對血液中基因組DNA進(jìn)行提取，包括如下步驟:
[0032