一種具有抑制乙酰膽堿酯酶功能的真菌菌株及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種具有抑制乙酷膽堿醋酶功能的真菌菌 株，本發(fā)明還設(shè)及該真菌菌株的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前乙酷膽堿醋酶抑制劑類藥物在阿爾茨海默病藥物市場(chǎng)上處于主導(dǎo)地位。石杉 堿甲為從民間草藥蛇足石杉中分離獲得的新型石松類單體生物堿，是一種強(qiáng)效的可逆性的 膽堿醋酶抑制劑，具有多祀點(diǎn)作用，對(duì)乙酷膽堿醋酶的抑制作用為毒扁豆堿的3倍、加蘭他 敏的30倍，而且外周不良反應(yīng)低，是治療阿爾茨海默病臨床優(yōu)選藥物之一。
[0003] 源于天然植物的藥物開發(fā)歷史悠久且富有生命力，植物提取獲得石杉?jí)A甲為最簡(jiǎn) 便方式，但植物提取獲得石杉?jí)A甲已面臨植物資源匿乏瓶頸;化學(xué)合成生產(chǎn)石杉?jí)A甲仍是 研發(fā)重要途徑之一，但合成步驟繁瑣、代價(jià)昂貴，很難獲得純光學(xué)活性的合成物。
[0004] 因此利用從野生蛇足石杉內(nèi)生真菌中篩選分離具有產(chǎn)石杉?jí)A甲能力的菌株對(duì)于 治療阿爾茨海默病和保護(hù)植物資源意義重大。雖然目前國(guó)內(nèi)外已有對(duì)產(chǎn)石杉?jí)A甲菌株進(jìn)行 開發(fā)和研究，但易脆毛霉菌(Mucor fragilis)具備產(chǎn)石杉?jí)A甲功能卻鮮有報(bào)道。對(duì)已獲得 的易脆毛霉菌(Mucor打agilis)NSY-l株可通過生物技術(shù)改造菌株為獲得石杉?jí)A甲工業(yè)化 生產(chǎn)提供新的菌種資源。同時(shí)，通過對(duì)其菌株產(chǎn)石杉?jí)A甲機(jī)理的研究，構(gòu)建新的轉(zhuǎn)基因生 物，使其獲得更優(yōu)良穩(wěn)定的產(chǎn)石杉?jí)A甲性狀和能力。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種具有抑制乙酷膽堿醋酶功能的真菌菌株，解決植物提取 獲得石杉?jí)A甲已面臨植物資源匿乏瓶頸;及化學(xué)合成步驟繁瑣、代價(jià)昂貴，很難獲得純光學(xué) 活性的合成物的問題。
[0006] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種具有抑制乙酷膽堿醋酶功能的真菌菌株的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是，一種具有抑制乙酷膽堿醋酶功能的真菌菌株，該菌 株為從野生蛇足石杉化uperzia serrata石杉科，石杉屬）內(nèi)生真菌中分離獲得，屬于毛霉 屬易脆毛霉種(Mucor打agilis)NSY-l株，在實(shí)驗(yàn)室傳代15代后具有遺傳穩(wěn)定性，其氨基序 列如沈Q ID NO: 1所示。
[000引本發(fā)明的特點(diǎn)還在于，
[0009] 該真菌菌株高效表達(dá)石杉?jí)A甲培養(yǎng)條件為：
[0010] (1)培養(yǎng)基：采用PDA液體培養(yǎng)基，具體配方為：馬鈴馨300g，葡萄糖20g，蒸饋水 1000ml；
[0011] (2)培養(yǎng)條件:26。(：，220以111111;
[001 ^ (3)裝液量：250ml錐形瓶，裝液量為100ml;
[OOU] (4)培養(yǎng)時(shí)間：7天。
[0014]該真菌菌株高效穩(wěn)定性表達(dá)石杉?jí)A甲時(shí)，該菌株的實(shí)驗(yàn)室保存條件為：（1)菌株每 次在PDA固體斜面?zhèn)鞔螅L(zhǎng)時(shí)間為84h;(2)保存菌種條件為4°C，1化后在將其放置-25°C 冰箱中進(jìn)行保存。
[0015] 本發(fā)明所采用的另一個(gè)技術(shù)方案是，一種高效表達(dá)石杉?jí)A甲并作為治療阿爾茨海 默病的功能菌株在生物合成制藥方面的應(yīng)用。
[0016] 本發(fā)明所采用的第Ξ個(gè)技術(shù)方案是，一種具有抑制乙酷膽堿醋酶功能的真菌菌株 的應(yīng)用，通過轉(zhuǎn)基因、誘變育種對(duì)真菌菌株進(jìn)行基因改造，W獲得表達(dá)效率更高、遺傳穩(wěn)定 性更好的系列菌株;但基因改造的技術(shù)手段并不限于此，也可W采用其他的生物技術(shù)進(jìn)行 基因改造方面的應(yīng)用。
[0017] 本發(fā)明的有益效果是，本發(fā)明具有抑制乙酷膽堿醋酶功能的真菌菌株，易脆毛霉 菌(Mucor打agilis)NSY-l株，可W作為治療阿爾茨海默病的生物菌株，將其優(yōu)良的產(chǎn)石杉 堿甲高效表達(dá)基因轉(zhuǎn)入其他模式菌株中，通過基因改造獲得更多的優(yōu)良性狀，此外還可通 過誘變育種達(dá)到菌株的進(jìn)一步優(yōu)化。對(duì)其研究將會(huì)為生物合成工業(yè)化生產(chǎn)石杉?jí)A甲，保護(hù) 植物資源、解決臨床一線用藥需求、降低治療阿爾茨海默病醫(yī)藥費(fèi)用有著巨大意義。
【附圖說明】
[0018] 圖1是本發(fā)明具有抑制乙酷膽堿醋酶功能的真菌菌株產(chǎn)石杉?jí)A甲能力與標(biāo)準(zhǔn)品高 效液相檢測(cè)對(duì)照?qǐng)D，圖中，a為石杉?jí)A甲標(biāo)準(zhǔn)品高效液相色譜，b為本發(fā)明菌株高效液相色 譜；
[0019]圖2為瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)NSY-1菌株中所抽提DNA的PCR產(chǎn)物電泳圖。圖中，A為電 泳PCR產(chǎn)物結(jié)果，其中A圖中第一條帶和第二條帶為菌株NSY-1檢測(cè)區(qū)，第；條帶為Marker檢 測(cè)區(qū);B為Marker大小標(biāo)示圖；
[0020]圖3為本發(fā)明具有抑制乙酷膽堿醋酶功能的真菌菌株光學(xué)顯微鏡圖，圖中，A為光 學(xué)顯微鏡下菌絲形態(tài)圖，B為光學(xué)顯微鏡下抱子梗和頂囊形態(tài)圖。
【具體實(shí)施方式】
[0021 ]下面結(jié)合附圖和【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。
[0022] 本發(fā)明一種具有抑制乙酷膽堿醋酶功能的真菌菌株，該菌株為從野生蛇足石杉 巧uperzia serra化石杉科，石杉屬）內(nèi)生真菌中分離獲得，屬于毛霉屬易脆毛霉種(Mucor fragilis)NSY-l株，在實(shí)驗(yàn)室傳代15代后具有遺傳穩(wěn)定性，其氨基序列如SEQ ID N0:1所 /J、- 〇
[0023] 該菌株已在國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局指定的保藏單位中國(guó)普通微生物菌種保藏中屯、保藏。
[0024] 生物材料保藏信息：
[0025] 名稱：易脆毛霉(Mucor 打agilis)NSY-l株
[0026] 保藏編號(hào):CGMCC No.12075
[0027] 保藏單位:中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中屯、(CGMCC)
[002引保藏時(shí)間：2016年01月15日
[0029] 地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)
[0030] ( - )本發(fā)明具有抑制乙酷膽堿醋酶功能的真菌菌株的分離方法如下：
[0031] 將新鮮蛇足石杉植株用自來水沖洗后，先用75%酒精進(jìn)行表面消毒30s，無菌水沖 洗4次，接著用10%化αο浸泡5min，無菌水沖洗4次，最后再用75%乙醇表面消毒30s，無菌 水沖洗4次后，用無菌刀片將莖切成0.5cm大小，葉片切成0.3cm X 0.3cm小塊，接種到含有15 μg/ml鏈霉素和Img/ml脫氧膽酸鋼的PDA固體培養(yǎng)基上，倒置于28°C培養(yǎng)箱中進(jìn)行暗培養(yǎng)。 為了檢驗(yàn)上述表面消毒是否徹底，同時(shí)把在消毒過程中最后一次沖洗組織塊的無菌水涂布 在培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。2~3d后，無菌操作法挑取在莖段和葉片切口上所長(zhǎng)出的菌絲，平板 劃線法轉(zhuǎn)接到新鮮的PDA平板上，重復(fù)上述操作直到得到純化的內(nèi)生真菌為止。
[0032] (二)具有抑制乙酷膽堿醋酶功能的真菌菌株發(fā)酵液制備：
[0033] 將分離得到的純化內(nèi)生菌分別接入裝有100ml PDA培養(yǎng)基的250ml錐形瓶(每個(gè)菌 株接3瓶），置于搖床上，26 °C、220r/min振蕩培養(yǎng)7d。設(shè)置3個(gè)重復(fù)。內(nèi)生真菌在振蕩培養(yǎng)7d 后，發(fā)酵液于lOOOOr/min離屯、15min。
[0034] (Ξ)具有抑制乙酷膽堿醋酶功能的真菌菌株產(chǎn)物分析測(cè)定
[0035] 取發(fā)酵液離屯、后的上清液50ml，采用氯仿和乙酸提取方法提取石杉?jí)A甲，用甲醇 定容到5ml，用高效液相法測(cè)定發(fā)酵上清液產(chǎn)石杉?jí)A甲的含量。高效液相化化C)色譜柱為 AgilentC18柱(4.60mmX250mm，5皿）；色譜條件為:流動(dòng)相為甲醇-0.1%甲酸(75:25);流 量1.0ml/min;柱溫25°C，進(jìn)樣量20μ1;檢測(cè)波長(zhǎng)31 Onm。W石杉?jí)A甲標(biāo)準(zhǔn)品作對(duì)照。
[0036] 精密稱取石杉?jí)A甲標(biāo)準(zhǔn)品20mg，溶于20mL蒸饋水中，再依次制備成0.05，0.025， 0.0125,0.006,0.003111旨/1111質(zhì)量濃度，分別進(jìn)樣2041。每次5次重復(fù)，^確定精密度良好。^ 峰面積與對(duì)應(yīng)石杉?jí)A甲標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性回歸方程。通過線性回歸方程計(jì) 算分離獲得產(chǎn)石杉?jí)A甲菌株代謝產(chǎn)物含量。結(jié)果表明石杉?jí)A甲