比色管中，于標(biāo) 準(zhǔn)管與試樣管中分別加入2mL 4g/L對(duì)氨基苯橫酸溶液，搖勻，靜置3-5min后，各加入ImL 2g/L鹽酸糞乙二胺溶液，加水至刻度，混勻，靜置15min，用分光光度計(jì)在OD540下測(cè)定吸光 度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，同時(shí)做試劑空白，見(jiàn)圖2所示；（2)降解亞硝酸鹽能力測(cè)定:樣品前處理： 稱(chēng)取lOg經(jīng)絞碎混勻的試樣，置于燒杯中，加12.5mL棚砂飽和液，攬拌均勻，W70°C左右的水 將試樣洗入500mL容量瓶中，于沸水浴中加熱15min，取出冷卻至室溫，加入5mL亞鐵氯化鐘 溶液，同時(shí)轉(zhuǎn)動(dòng)搖勻，再加入5mL乙酸鋒溶液，沉淀蛋白質(zhì)，加水至刻度，搖勻，放置30min，過(guò) 濾，棄去初濾液30mL，濾液備用。
[0033] 亞硝酸鹽測(cè)定步驟同亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定除將亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)使用液換成泡 菜樣品處理液。
[0034]
[0035] 亞硝酸鹽含量計(jì)算公式：
[0036] 式中，X為試樣中亞硝酸鹽的含量，單位為mg/kg;m為試樣質(zhì)量，單位為g;A為測(cè)定 用樣液中亞硝酸鹽的質(zhì)量，單位為ug ; Vl為試樣處理液總體積，單位為1^; V2為測(cè)定用樣液 體積，單位為mL。亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖2。
[0037] 各分離菌株對(duì)亞硝酸鹽降解能力結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知，MRS培養(yǎng)基發(fā)酵液中亞硝 酸鹽殘留量最少為A2菌株，該菌株在4她內(nèi)降解率可高達(dá)96.88%，由此可確定A2菌株即為 產(chǎn)酸能力強(qiáng)、高效降解亞硝酸鹽能力的乳酸菌株。
[0038] 產(chǎn)酸能力強(qiáng)、高效降解亞硝酸鹽的菌株的分子生物學(xué)鑒定
[0039] 對(duì)獲得的產(chǎn)酸能力強(qiáng)、高效降解亞硝酸鹽的乳酸菌株進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，將分 離菌株測(cè)出的序列在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行序列比對(duì)，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，見(jiàn)圖4,確定所篩得的 乳酸菌株的種屬。將菌株保藏于中國(guó)典型微生物保藏中屯、，乳酸菌株種屬及保藏編號(hào):植物 乳桿菌（Lactobacillus plantarunOCCTCC M:2015184。
[0040] 乳酸菌活菌菌劑的制備
[0041 ]菌泥制備:將植物乳桿菌菌株接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)1她至生長(zhǎng)對(duì)數(shù) 末期，400化/min離屯、lOmin，用0.85 %的化C1溶液沖洗3次，收集菌泥；懸浮液制備:將4.0- 6.0%(w/V)脫脂乳、4.0-6.0%(*八)海藻糖、2.0-4.0%(*八)谷氨酸鋼作為噴霧干燥復(fù)配 保護(hù)劑，于蒸饋水中加熱溶解，冷卻后將菌泥與保護(hù)劑按比例l:3(g:L)重懸于復(fù)配保護(hù)劑 中，進(jìn)行干燥;干燥條件:進(jìn)口溫度為130°C，進(jìn)樣量60mL/h，風(fēng)機(jī)功率90%，清洗噴嘴頻率4， pH值為4.47，此時(shí)植物乳桿菌的存活率為82.3%，活菌數(shù)為2.7 X 108c化/mL。
[0042] 泡菜鹽配方的確定
[0043] 將泡菜鹽按6.0-8.0% (w/v)的濃度加至冷卻至室溫的冷開(kāi)水中，蔬菜洗凈驚干后 加入其中，密閉，騰制成熟即可使用，蔬菜的加入量kg:冷開(kāi)水體積L=l:2。將乳酸菌活菌菌 劑按0.00%、0.15%、0.30%、0.45%、0.60%(w/w)添加至食用鹽中，混合均勻，制備成泡菜 鹽，W泡菜騰制過(guò)程中泡菜產(chǎn)酸速率和亞硝酸鹽降解率為指標(biāo)，將確定泡菜鹽配方，結(jié)果 見(jiàn)圖5、圖6。由圖5可知，添加有該泡菜鹽的試驗(yàn)組產(chǎn)酸速率明顯比未添加該泡菜鹽組高，產(chǎn) 酸速率高可抑制泡菜中腐敗菌的生長(zhǎng)，延長(zhǎng)泡菜的保質(zhì)期，且酸能分解亞硝酸鹽，降低泡菜 中亞硝酸鹽、增加泡菜的食用安全性。由圖6可知，該試驗(yàn)組的最終亞硝酸鹽降解率大多能 達(dá)到99% W上（除了接種量為0.15%的試驗(yàn)組降解率為78.96%)，而泡菜鹽接種量為 0.00% (w/w)的泡菜亞硝酸鹽降解率僅為41.25%，從泡菜鹽生產(chǎn)成本、泡菜乳酸含量及亞 硝酸鹽降解率等方面考慮，該泡菜鹽在泡菜制作工藝中最適添加量選擇〇.45%(w/w)為宜。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種高效降解亞硝酸鹽的乳酸菌，其特征在于：該乳酸菌的分類(lèi)命名為植物乳桿菌 Lactobacillus plantarum，所述植物乳桿菌的菌株保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏 編號(hào)為CCTCC N0:M 2015184。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效降解亞硝酸鹽的乳酸菌，其特征在于具有如下特征:該植 物乳桿菌的菌株在發(fā)酵液中4811內(nèi)的產(chǎn)酸速率為3.0\1(^ 2至4.0\10^；/1001^.11，對(duì)亞硝 酸鹽的降解率為88.0-98.0%。3. -種根據(jù)權(quán)利要求1所述的高效降解亞硝酸鹽的乳酸菌在泡菜鹽中的應(yīng)用，其特征 在于：泡菜鹽在泡菜腌制過(guò)程中，發(fā)酵7d，泡菜乳酸生成速率為1.0 X 10-3至1.5 X l(T3g/ 100mL · h，亞硝酸鹽含量為 0· 026-1 · 301mg/kg，降解率為 95 · 0-99 · 9%。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述高效降解亞硝酸鹽的乳酸菌在泡菜鹽中的應(yīng)用，其特征在于:將 植物乳桿菌活菌菌劑按〇 . 15%(?7/'\￥)-0.60%(?7/'\￥)添加至食用鹽中制得預(yù)混小樣，再將預(yù)混 小樣與其余食鹽在混料機(jī)中緩慢、勻速混勻，即制得泡菜鹽。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述高效降解亞硝酸鹽的乳酸菌在泡菜鹽中的應(yīng)用，其特征在于所 述的植物乳桿菌通過(guò)噴霧干燥制備成活菌劑，具體包括以下步驟： (1) 菌泥制備:將植物乳桿菌菌株接種于MRS液體培養(yǎng)基中，于37°C培養(yǎng)18h至生長(zhǎng)對(duì)數(shù) 期的末期，4000 r/min離心10 min，用質(zhì)量百分含量為0.85%的NaCl溶液沖洗3次，收集菌 泥； (2) 乳酸菌活菌菌劑干燥:將4.0-6.0%(w/V)脫脂乳、4.0-6.0%(w/V)海藻糖、2.0-4.0% (w/V)谷氨酸鈉作為噴霧干燥復(fù)配保護(hù)劑，于蒸餾水中加熱溶解，冷卻后將菌泥與保護(hù)劑按 比例l:3(g:L)重懸于復(fù)配保護(hù)劑中，進(jìn)行干燥后得活菌劑，該菌劑中植物乳桿菌的存活率 為82.3%，活菌數(shù)為2.7\10 8〇如/111匕6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述高效降解亞硝酸鹽的乳酸菌在泡菜鹽中的應(yīng)用，其特征在于步 驟(2)中所述的干燥，其干燥條件為:進(jìn)口溫度為130°C，進(jìn)樣量60mL/h，風(fēng)機(jī)功率90%，清洗 噴嘴頻率4, pH值為4.47。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種高效降解亞硝酸鹽的乳酸菌及其在泡菜鹽中的應(yīng)用。該乳酸菌的分類(lèi)命名為植物乳桿菌<i>Lactobacillus？plantarum</i>，所述植物乳桿菌的菌株保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC？NO：M？2015184，該植物乳桿菌的菌株在發(fā)酵液中48h內(nèi)的產(chǎn)酸速率為3.0×10-2至4.0×10-2g/100mL.h，對(duì)亞硝酸鹽的降解率為88.0-98.0%。本申請(qǐng)中篩選獲得的乳酸菌菌株產(chǎn)酸能力強(qiáng)、能高效降解亞硝酸鹽，將其通過(guò)噴霧干燥制備成活菌菌劑，添加至食用鹽中制成泡菜鹽，用于泡菜腌制，具有乳酸發(fā)酵迅速、降解亞硝酸鹽能力強(qiáng)的特點(diǎn)，可極大提高泡菜食用安全性。CCTCC NO：M201518420150331
【IPC分類(lèi)】A23L27/40, C12N1/20, A23L29/00, C12R1/25
【公開(kāi)號(hào)】CN105670974
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610141101
【發(fā)明人】黃丹, 劉有晴, 羅惠波, 于華, 毛祥, 葉光斌
【申請(qǐng)人】四川理工學(xué)院
【公開(kāi)日】2016年6月15日
【申請(qǐng)日】2016年3月14日